導語：如何才能寫好一篇免疫學分析法，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

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化學發(fā)光免疫分析包括三大類型: 即標記化學發(fā)光物質(zhì)的化學發(fā)光免疫分析、 標記熒光物質(zhì)的熒光化學發(fā)光免疫分析和標記酶的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析?；瘜W發(fā)光免疫分析技術(shù)可測定內(nèi)分泌激素、 腫瘤標志物、 血藥濃度、 傳染病和心血管疾病標志物、 貧血及過敏原等項目［1］。目前對運動員血清睪酮的檢測， 大多采用放射免疫法， 由于其自動化程度低， 不適用于快速檢測， 又有放射污染。美國Beckman．Coulter公司和法國Pasture研究院合作生產(chǎn)的Access全自動微粒子化學發(fā)光免疫分析儀， 其方法學具有高靈敏性、 高精確性、 高穩(wěn)定性等特點， 無需對樣本進行測前處理， 簡便的自動化操作， 全程僅需15～20 min， 且無放射污染。本室引進Access免疫分析系統(tǒng)對運動員血清T進行定量測定， 現(xiàn)對該方法的臨床應用評價如下。

1 材料和方法

1.1 檢測對象 無錫市體育管理中心運動員122人， 年齡≥15歲， 其中男64人， 女58人。對照組為來我院正常體檢的中學生， 男、 女各30人。采運動員清晨靜脈血2 mL， 分離血清后進行檢測。

1.2 材料 血清睪酮的檢測采用Access磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析系統(tǒng)。Access免疫分析系統(tǒng)及配套的T試劑盒， 沖洗緩沖液， 堿性液， 酸性液， 定標液， 基質(zhì)液(Substrste)， 反應杯(RV管)由BeckmanCoulter公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線 分別取0、 1.7、 5.2、 13.9、 27.8、 55.5 nmol/L T標準液， 在Access免疫分析系統(tǒng)中執(zhí)行自動定標程序。以2次測定結(jié)果的均值， 進行數(shù)學邏輯處理， 繪制標準曲線。

1.3.2 統(tǒng)計學分析 兩組間數(shù)據(jù)采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 精密度測試 取低、 中、 高值的混合血清分別重復測定20次， 計算變異系數(shù)CV， 反映批內(nèi)精密度。每天對不同濃度的質(zhì)控血清測定1次， 連續(xù)20 d， 評價批間精密度。低、 中、 高值批內(nèi)CV分別為4.1、 2.7、 1.6; 批間CV 分別為4.4、 3.2、 2.6。

2.2 血清睪酮檢測結(jié)果及統(tǒng)計分析 運動員血清睪酮檢測結(jié)果顯示， 男女運動員與各自相同性別正常人對照組之間無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 表1 運動員血清睪酮檢測

3 討論

Access免疫分析通過在RV管中加入包被單克隆抗體的磁性微粒、 血清樣品、 堿性磷酸酶(ALP)標記的抗原， 經(jīng)37℃孵育后， 形成競爭法抗原抗體結(jié)合成的復合物。再加入底物 AMPDD(一種金剛基二螺［4， 4］二氧乙烷的磷酸脂)發(fā)光劑。AMPDD經(jīng)ALP水解， 生成一種不穩(wěn)定的陰離子， 該陰離子分解時持續(xù)發(fā)光， 且與ALP量成正比， 通過測定相對發(fā)光單位(relative light unit， RLU)定量檢測血清中物質(zhì)的濃度［2］。

對運動員血清T檢測結(jié)果表明， CV％值較小， 說明儀器重復性較好， 測定結(jié)果穩(wěn)定。 T的測定濃度范圍在0～55.5 nmol/L之間， 能夠滿足運動員正常測試的需要。自動化的Access免疫分析系統(tǒng)， 既具有化學發(fā)光檢測的高靈敏度， 又具有免疫分析的高特異性， 準確性、 穩(wěn)定性， 能夠快速及時的為運動員訓練監(jiān)控提供可靠的依據(jù)。另外， 它是用化學試劑來標記抗原或抗體， 避免了因使用放射性核素而帶來的對人體和環(huán)境的危害。

但由于試劑成本的原因， Access免疫分析系統(tǒng)仍未廣泛應用于臨床。隨著臨床需求的進一步擴展， 高靈敏度、 寬線性Access免疫分析系統(tǒng)的將得到廣泛應用。

參考文獻

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[關(guān)鍵詞]梅毒；血清學檢驗；CMIA；GICA

流行病學調(diào)查顯示梅毒是我國二類傳染病報告中排名第三的傳染性疾病，梅毒螺旋體是梅毒的病原體。性傳播是梅毒的主要傳播途徑，占所有傳播途徑的95%，大量存在于皮膚黏膜損害表面，也見于唾液、乳汁、、尿液中。未經(jīng)治療的病人在感染1年內(nèi)最具傳染性，隨病期延長，傳染性越來越小，病期超過4年者，通過性接觸無傳染性。目前，對于梅毒的診斷主要依據(jù)病史、臨床癥狀和血清學診斷聯(lián)合判斷，該方法耗時長、操作復雜，給梅毒的診斷和治療帶來極大的不便。目前，梅毒的血清學檢測主要是由TPPA、ELISA和TRUST等檢測方法。TPPA是目前臨床公認的梅毒檢測金標準，然而該方法操作繁瑣且依賴肉眼判斷實驗結(jié)果，對檢測者的實驗技術(shù)和經(jīng)驗有較高的要求。ELISA和TRUST法各有優(yōu)劣但均無法替代TPPA。CMIA是一種新型的TP抗體檢測試驗，有報道稱其具有良好的準確性和特異性。GICA是在酶聯(lián)免疫吸附、單克隆抗體技術(shù)、乳膠凝集試驗和膠體金技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展出的新技術(shù)，具有靈敏、方便等優(yōu)勢。因此，本研究擬探討CMIA和GICA的優(yōu)劣，為改善梅毒的診斷提供數(shù)據(jù)支持。

1.材料與方法

1.1材料

收集我院2014年1月至2015年1月皮膚與性病科送檢血清樣本1500例，其中男性1047例，女性453例，年齡16～89歲，平均（36.8±8.2）歲。排除：（1）已接受抗梅毒治療、免疫治療患者；（2）拒絕入組患者。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑

采用美國貝克曼公司設(shè)計生產(chǎn)的全自動微粒子化學發(fā)光儀DxI-800及其配套試劑、定標液和質(zhì)控品（批號：224751）。TPPA和GICA試劑盒、酶標儀和指示板由美國羅氏公司提供（批號：20140510）。

1.3方法

空腹采血3mL，離心得到血清后分別采用TPPA、GICA、CMIA法進行檢測，操作嚴格依據(jù)試劑盒說明書進行。GICA法使用TPl5、TPl7、TP44.5和TP47的金顆粒分別加入陽性對照和陰性對照及樣品中，反應0.5h后清洗并在全自動微粒子化學發(fā)光儀中進行檢測，記錄各孔的發(fā)光強度。CMIA法從測試到結(jié)果判讀均由儀器全自動完成，以S/CO>1.0為梅毒檢驗陽性。TPPA以反應孔中細胞沉積在孔中央呈光滑紐扣狀為陰性，反應孔出現(xiàn)凝集呈不規(guī)則沉積為陽性。當?shù)味取?：80時判讀為陽性，對于弱陽性標本需重復測定2次，復檢2次全為陰性時判讀為陰性，否則結(jié)果判讀為陽性。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0軟件分析，檢測結(jié)果采用配對四格表計算敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值，兩種方法間比較采用X2檢驗。

2.結(jié)果

采用TPPA檢測法對1500例血液樣本進行梅毒檢測，檢出陽性樣本182例、陰性樣本1318例，陽性率12.1%。

2.1兩種方法檢測結(jié)果比較

在陽性樣本中CMIA法檢測結(jié)果優(yōu)于GICA法（P0.05）。見表1。

2.2兩種檢測方法實驗特性比較

CMIA的靈敏性和陰性預測值優(yōu)于GICA法（P

3.討論

在梅毒螺旋體初次感染人體后會進入潛伏期，潛伏期的梅毒感染臨床癥狀不顯著，診斷存在困難，而在進入潛伏期2～4周后便會產(chǎn)生特異性的抗梅毒螺旋體抗體，因此針對這些抗體進行檢測有助于梅毒的早期診斷和治療。同時，梅毒發(fā)病率的上升也對臨床輸血工作造成了嚴重的威脅。目前，國內(nèi)醫(yī)院或?qū)嶒炇抑饕褂梅翘禺愋悦范韭菪w檢測方法進行，檢測如性病研究實驗室實驗（VDRL）和快速血漿反應素環(huán)狀卡片實驗（RPR）等。

CMIA檢測梅毒的原理是將重組的梅毒螺旋體抗原（Tpnl5、17和47）包裹并與檢驗稀釋液混合后加入樣本，若血樣中存在梅毒螺旋體抗體，則會結(jié)合在抗原包被粒子上，加入預觸發(fā)液和觸發(fā)液后，測的化學發(fā)光反應無的相對單位，進而檢測梅毒螺旋體感染情況。張東梅等比較了CMIA法與TPPA法測定梅毒感染的效果證實，兩種檢測方法具有極高的一致性，但認為在CMIA法S/CO值為1.0～4.0時需進一步復檢。

GICA法是一種結(jié)合了色譜層析和免疫反應兩種技術(shù)優(yōu)勢的體外診斷技術(shù)。通過高純度的梅毒螺旋體抗原高選擇性結(jié)合樣品中的抗體，并通過色譜層析的方式分離，僅需一次上樣不需要任何儀器設(shè)備輔助就能高效準確的測定樣本中抗體含量。磁性微粒因為具有超順磁性因此分離簡單且具有較大的單位表面積，因此反應靈敏。張鵬比較了GICA和ELISA技術(shù)在梅毒檢測中的效果證實GICA與ELISA和TPPA檢測法結(jié)果差異均無統(tǒng)計學意義，但該方法操作更為簡便。楊璐對GICA法進行評估后認為該檢測方法具有很高的靈敏度和特異性且簡單易行，具有較高的應用價值。

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【關(guān)鍵詞】化學發(fā)光免疫法；放射免疫法；AFP；分析性能；實驗方法

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.01.672文章編號：1004-7484（2014）-01-0556-02

化學發(fā)光免疫分析是一種新型的標記免疫分析技術(shù)，是繼放射免疫、酶免疫、熒光免疫分析等分析方法之后的新一代標記免疫分析技術(shù)，是將免疫測定與化學發(fā)光相結(jié)合的新型技術(shù)。整個過程均在全封閉的反應體系中進行，且能夠全自動操作，儀器具有反應迅速，靈敏度高，檢測限低等優(yōu)點，總的來說包括抗原抗體特異性結(jié)合與化學發(fā)光兩部分過程[1]。甲胎蛋白（AFP）是原是胚胎的肝細胞，嬰兒兩個月便逐漸消失，但近些年發(fā)現(xiàn)AFP在部分成人體內(nèi)出現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)它是原發(fā)性肝癌最靈敏，也是最特異的腫瘤標志物。為了進一步考察該儀器對AFP生物檢測限和AFP功能靈敏度的測量，我院參照IUPAC（國際純粹和應用化學聯(lián)合會）的規(guī)定評價方案，現(xiàn)將60例臨床送檢血清標本的臨床資料進行報道如下：

1材料與實驗方法

1.1應用材料與儀器檢測樣選用我院2013年1月至2013年3月的60例臨床送檢血清標本。

儀器采用美國Bayer Centaur 240全自動化學發(fā)光儀，并配套相關(guān)檢測試液（包括標記的抗原抗體、含磁性的固相顆粒、稀釋液、AFP清洗液、發(fā)光試劑等），均采用拜耳公司提供的試劑。放射免疫法采用上海產(chǎn)的γ計數(shù)儀（SN-682 型），并配套運用 AFP 試劑盒（中國原子能科學研究所研制）。

1.2方法檢測時運用AFP稀釋液作為空白樣品，取一新鮮的血清作為試樣，做重復性實驗，記錄每次檢測的濃度值和光強度值。核實兩者的精密度、靈敏度與檢出限等，數(shù)據(jù)處理采用線性回歸處理。

1.3統(tǒng)計學方法根據(jù)SPSS13.0軟件對提供的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學的分析，計量資料為t檢驗，對所有統(tǒng)計結(jié)果采用均數(shù)±標準差（χ±s）的形式表示，運用軟件進行處理（檢驗水準α=0.05，雙側(cè)檢驗）作為統(tǒng)計學的評定標準具有統(tǒng)計學的差異。

2結(jié)果

2.1線性試驗以AFP稀釋液作為空白試劑，再根據(jù)要求將標準溶液稀釋成不同濃度的溶液，放射免疫法取5ppb、10ppb、50ppb、200ppb、400ppb為標準濃度測定標準曲線，化學發(fā)光免疫法取5ppb、10ppb、50ppb、200ppb、400ppb、800ppb為標準濃度測定標準曲線，結(jié)果兩組數(shù)據(jù)均有較好的線性關(guān)系。

2.2重復性試驗取一新鮮的血清作為試樣，兩種方法均進樣10次，查看兩者的重復性差別，兩組儀器均能滿足RSD

2.3相關(guān)性試驗采用2.2中的方法用上述兩種檢測法對受檢血清標本進行適當定量分析。結(jié)果顯示，兩種方法無顯著差異（P>0.05），且相關(guān)系數(shù)r=0.995，回歸方程為y=-1.059+0.921x，兩組方法所得數(shù)據(jù)的相關(guān)性良好。

2.4回收率試驗取混合血清后，再加不同濃度的標準定值血清，用兩組方法分別對其進行平均回歸率實驗，實驗得出，放射免疫法的回收率為91.2-108.1%，化學發(fā)光免疫法的回收率為92.0-107.8%?；瘜W發(fā)光免疫法略優(yōu)于放射免疫法。

2.5檢出限以每次做的空白RLUs為基值，以該空白的RLUs值的3倍作為樣品中具有的AFP量，或稱本法的檢測低限。分別對兩種方法進行檢出限測量，得出化學發(fā)光免疫法的檢出限為0.95ppb，放射免疫法的檢出限為5ppb?；瘜W免疫法在檢出限上明顯優(yōu)于放射免疫法[2]。

2.6精密度試驗取三個梯度濃度（分為低、中、高三個梯度）的試劑分別進行精密度實驗，并運用兩種方法進行整理對比，見表1。

3討論

化學發(fā)光免疫技術(shù)作為一種新型的分析技術(shù)，既具有運用發(fā)光檢測時的高度敏感性，也同時具有免疫分析時的高度特異性。其原理為將激發(fā)態(tài)分子回到基態(tài)時所釋放而產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象，再運用化學發(fā)光系統(tǒng)來為抗原抗體的結(jié)合反應做指示系統(tǒng)，從而進行定量檢測抗原或抗體的濃度方法，是一種直接的運用發(fā)光劑標記抗體的免疫分析方法。由于運用丫啶酯發(fā)光劑的優(yōu)點可以很好的減少非特異性干擾，反應較為簡單且迅速，反應靈敏度高，據(jù)有關(guān)資料顯示，該發(fā)光劑也很穩(wěn)定（有效期可長達1年以上）。

放射免疫法是目前臨床上較為常用的分析方法，其原理是放射性標記的抗原和非標記抗原全部同時與限量的特異性抗體進行競爭性可逆的結(jié)合反應，反應的靈敏度較低，標記物的有效期也較短（一般只有1個月左右）。從工作人員角度來說，也會對他們的身體健康帶來很多負面影響。從以上的結(jié)論可以看出，兩種方法的檢測結(jié)果無顯著性差異，且相關(guān)性較好。但從檢出限、靈敏度、精密度等方面進行比較，化學發(fā)光免疫法就明顯優(yōu)于放射免疫法，而且其試劑穩(wěn)定性高、毒性小，對環(huán)境無過大污染，方便、易操作且安全。

本實驗采用的全自動化學發(fā)光儀可以很好地對血清標本進行很好地采樣，處理和檢測，基本上能夠達到樣品隨到隨測，檢測迅速，很快可以得到檢測結(jié)果，大大縮短了檢測所用的時間，能滿足臨床上的檢驗需求[3]。從上述數(shù)據(jù)可以確認，該方法的檢測結(jié)果均可以達到臨床運用水平，又基于其高度特異性、靈敏度高、重復性好等優(yōu)勢，值得臨床進一步廣泛應用。

參考文獻

[1]張紅祥.化學發(fā)光免疫法與放射免疫法檢測血清AFP臨床分析[J].中國現(xiàn)代藥學應用，2010，4（7）：41-42.

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關(guān)鍵詞：甲狀腺疾病;化學發(fā)光免疫技術(shù);應用;效果

甲狀腺疾病為常見臨床疾病，常通過檢測患者甲狀腺球蛋白進行診斷。傳統(tǒng)檢測方法為放射免疫技術(shù)、血凝法等，但檢測效果不甚理想?；瘜W發(fā)光免疫技術(shù)具有穩(wěn)定性高、靈敏度高和操作方便等優(yōu)點，標本用量較少，且標記物易得[1]?，F(xiàn)搜集2013年7月―2014年7月我院接診的甲狀腺疾病45例、甲狀腺腫瘤45例、甲亢45例患者，對其化學發(fā)光免疫技術(shù)的應用效果進行總結(jié)性分析，并將分析結(jié)果報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 將2013年7月―2014年7月我院接診的甲狀腺疾病45例患者作為甲組，平均年齡是（29.32±10.25）歲，男患者和女患者分別是23例、22例;將甲狀腺腫瘤45例患者作為乙組，平均年齡是（29.39±10.25）歲，男患者和女患者分別是24例、21例;將甲亢45例患者作為丙組，平均年齡是（29.48±10.22）歲，男患者和女患者分別是25例、20例;將同期正常體檢人群45例作為丁組，平均年齡是（30.07±1.12）歲，男性和女性分別是22例、23例。甲組、乙組、丙組和丁組的一般臨床資料相比，無明顯差異，無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

1.2 方法 在受檢者空腹情況下采3ml血，抗凝劑選擇肝素鈉，通過放射免疫技術(shù)對血漿甲狀腺球蛋白進行檢測;后選擇化學發(fā)光免疫全自動分析儀檢測。比較甲組、乙組、丙組和丁組假陰性、假陽性和檢測濃度。對比不同檢測方法的符合率、特異性及靈敏度。

1.3 統(tǒng)計學分析 對本文所得實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行檢驗，所得計量資料采用t檢驗，所得計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 假陰性及假陽性結(jié)果 與放射免疫技術(shù)相比，四組經(jīng)化學發(fā)光免疫技術(shù)檢測假陰性及假陽性率較低，有明顯差異，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。四組檢測結(jié)果比較情況見表一。

表一 四組假陰性及假陽性結(jié)果對比

2.2 甲狀腺球蛋白檢測濃度 與放射免疫技術(shù)相比，經(jīng)化學發(fā)光免疫技術(shù)檢測的甲狀腺球蛋白濃度較高，有明顯差異，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。四組不同檢測方法甲狀腺球蛋白濃度比較情況見表二。

表二 四組不同檢測方法甲狀腺球蛋白濃度對比

2.3 符合率、特異性及靈敏度 與放射免疫技術(shù)相比，四組化學發(fā)光免疫技術(shù)檢測符合率、特異性及靈敏度較高，有明顯差異，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。四組不同檢測方法符合率、特異性及靈敏度比較情況見表三。

表三 四組不同檢測方法符合率、特異性及靈敏度對比

3 討論

放射免疫技術(shù)假陰性率及假陽性率較大，試劑有效期較短，且具有一定放射性，限制臨床應用。該技術(shù)又分為發(fā)光反應和免疫反應，在抗原或抗體上標記化學發(fā)光劑，將其與待測標本抗體或抗原經(jīng)特異性反應相互結(jié)合，產(chǎn)生復合物，通過磁場對結(jié)合態(tài)、游離態(tài)進行分離，加入發(fā)光底物或氧化劑，促使物質(zhì)氧化，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)中間體，躍遷至基態(tài)，發(fā)射光子，經(jīng)發(fā)光強度檢測進行定性檢測和定量檢測[2]。該技術(shù)主要適用于腫瘤標志物分析、心臟疾病標記物測定、激素分析等。甲狀腺疾病患者的甲狀腺功能主要依靠檢測甲狀腺球蛋白判斷，因此，必須加強對患者甲狀腺球蛋白的定量檢測[3]。在本文研究中，對甲組、乙組、丙組和丁組分別進行放射免疫技術(shù)及化學發(fā)光免疫技術(shù)檢測，結(jié)果顯示，甲組經(jīng)放射免疫假陰性率為8.89%，經(jīng)化學發(fā)光免疫假陰性率為2.22%;乙組分別為11.11%、2.22%;丙組分別為6.67%、0%;丁組假陽性率分別是4.44%、2.22%，表明化學發(fā)光免疫技術(shù)可有效檢測甲狀腺疾病，假陰性率及假陽性率較低。甲組、乙組、丙組和丁組經(jīng)不同方法檢測甲狀腺球蛋白，化學發(fā)光免疫技術(shù)檢測濃度均高于放射免疫技術(shù)，表明化學發(fā)光免疫技術(shù)對有效檢測甲狀腺球蛋白具有重要作用。化學發(fā)光免疫技術(shù)檢測符合率、特異性及靈敏度均高于放射免疫檢測，表明化學發(fā)光免疫技術(shù)具有較高的檢測特異性及靈敏度，符合率較高。

綜上認為，化學發(fā)光免疫技術(shù)在臨床上應用價值較大，能為臨床診斷甲狀腺疾病提供有力依據(jù)，應予以推廣。

參考文獻：

[1] 李曉霞.化學發(fā)光免疫分析[J].延安大學學報（醫(yī)學科學版）.2012，16（17）：50-51.

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【關(guān)鍵詞】 造血干細胞 CD117+細胞 免疫磁珠分離法 小鼠 近交BALBC

造血干細胞（HSCs）研究面臨的首要問題是獲得大量純化的造血干細胞，并去除雜質(zhì)細胞對實驗的干擾[1，2]，近年在純化技術(shù)方面的研究不多，尤其是對小鼠的研究較少。CKit或干細胞因子受體SCFR（CD117）是小鼠HSCs的主要標志[3]，2006年采用免疫磁珠分離法(MACS)分選骨髓造血干細胞亞群CD117，并用流式細胞儀進行計數(shù)，希望為造血干細胞的純化和大量制備提供實驗方法和理論支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

BALB/C小鼠，(20±1)g，雌雄隨機，10只/組，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。

1.2 試劑和儀器

BSA購自杭州四季青生物工程材料研究所，熒光標記小鼠抗體CD117PE磁珠試劑盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分離器及MS分離柱，均購自Miltenyi Biotec公司，流式細胞儀(FACS Calibur)購自BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠骨髓細胞收集

頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠股骨、脛骨，放在盛有緩沖液（含2 mmol/L EDTA，0.5%BSA的PBS）的平皿中，去除骨上的肌肉組織及骨膜，切除骨的兩末端，用1 ml注射器（帶4號針頭）插入股骨膝蓋端、脛骨骨端，用緩沖液反復沖洗骨腔，直至骨發(fā)白，所得細胞過200目濾網(wǎng)，1 500 r/min離心10 min，小心去除上清液，加入5 ml緩沖液混勻，進行細胞計數(shù)。

1.3.2 MACs分離CD117細胞

1.3.2.1 小鼠系別細胞去除 用緩沖液按40 μl/107個細胞重懸小鼠骨髓細胞。加入生物素化抗體混合物10 μl/107個細胞，混勻，4～8 ℃孵育10 min。加入緩沖液30 μl/107個細胞，20 μl抗生物素微珠，混勻，4～8 ℃孵育15 min。加入5 ml緩沖液洗滌細胞，1 500 r/min離心10 min，完全去除上清液。

1.3.2.2 磁性標記和分選CD117細胞 將分選后得到的細胞用緩沖液按80 μl/107個細胞重懸。加入CD117微珠20 μl/107個細胞，混勻，4～8 ℃孵育15 min，緩沖液1 ml/107個細胞洗滌細胞，1 500 r/min離心10 min，完全去除上清，用500 μl緩沖液重懸，所得細胞懸液加入MS分選柱中，收集先行流出的未標記細胞組分，并用1 500 μl緩沖液沖洗MS柱，此為CD117陰性細胞。將分選柱移出磁場，1 ml緩沖液快速將分選柱上滯留的細胞洗脫下來，這些細胞是磁性標記的CD117陽性細胞。

1.3.3 流式細胞儀分析

將分選前的標本、對照管、分選后陰性管標本及分選后陽性管標本進行流式細胞儀分析。在上述富集細胞管中加入100 μl緩沖液，10 μl CD117抗體混勻，4 ℃黑暗中孵育10 min，加入1 000 μl緩沖液1 500 r/min離心10 min，完全去除上清液，加入500 μl緩沖液混勻，送流式細胞分析，設(shè)陰性對照和空白對照。

1.3.4 細胞染色計數(shù)

0.4% 臺盼藍按9∶1（V∶V，細胞懸液量：染色液量）對細胞進行染色。鏡下觀察，死細胞被染成淡藍色，而活細胞拒染。細胞活力的測定: 0.4% 臺盼藍染色1 min，計算活細胞率，活細胞率（%）=活細胞總數(shù)/（活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù)）×100%。

1.4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 11.1進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析，用配對樣品t檢驗，P

2 結(jié)果

2.1 骨髓細胞的收集

從1只小鼠股骨、脛骨可收集5.25×107個骨髓細胞，細胞活力90%，2只小鼠股骨、脛骨可收集8.48×107個骨髓細胞，細胞活力92%。

2.2 MACS分選造血干細胞

1只小鼠股骨、脛骨可收集（1.1±0.3）×105個造血干細胞。

2.3 流式細胞儀分析結(jié)果

免疫磁珠純化前CD117陽性細胞純度為（41.56±18.77)% ，純化后CD117陽性細胞純度為(88.68±4.74)%，純化前后有明顯差異（P

3 討論

骨髓內(nèi)主要有兩類干細胞群體，即造血干細胞(hematopoietic stem cells， HSCs)和間充質(zhì)干細胞(MSCs)。HSCs是卵黃囊、胎肝和骨髓中比例極小的細胞群， 成年小鼠HSCs占整個骨髓細胞的0.01%～0.05% [4]，具有自我更新的能力， 能維持宿主終生造血功能和分化，生成血液中的各種成熟細胞[5]，獲取高度均一的HSCs是開展細胞生物學特性等各項研究的基礎(chǔ)。

CD117干細胞因子受體是具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體，廣泛分布于HSCs群中，60%～75%的CD34+造血干細胞同時表達CD117，其配體——干細胞因子(SCF，)在HSCs的生存和增埴、分化中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)CD34+CD117+比CD34+CD117-細胞具有更高的集落形成能力，而 CD117可高頻率表達于多能干細胞表面，對HSCs的分化具有重要作用，是小鼠HSCs的重要標志[6]。CD117也存在于肥大細胞和急性髓樣白血病細胞表面[7]。

細胞分離或純化的目的是收獲高純度保持原有活性的單一細胞群，并最大限度地減少靶細胞的丟失。免疫磁珠是一種包被有單克隆抗體的磁性微粒， 它可特異性地與靶物質(zhì)(細胞、蛋白質(zhì)、DNA 和細菌等) 結(jié)合， 使之具有磁順應性， 繼而在外加磁場的作用下被滯留， 從而與其他成分分離， 達到富集純化的目的[8，9]。MACS 根據(jù)最終選留物質(zhì)的不同可分為陽性選擇(留取與磁珠結(jié)合的陽性物質(zhì)) 和陰性選擇(留取不與磁珠結(jié)合的陰性物質(zhì))。本實驗采用免疫磁珠(MACS) 陽性選擇法分選HSCs，從1只小鼠股骨、脛骨可收集（1.1±0.3）×105個HSCs，先進行系別細胞去除的陰性分選，去除成熟造血細胞（T細胞、B細胞、單核細胞或巨噬細胞、粒細胞、紅系細胞及其定向前體細胞），細胞與一系列生物素化的抗系別抗原抗體和抗生物素磁珠共同孵育，磁性標記后去除系別細胞，這種標記過程保留了系別標志陰性的細胞，可根據(jù)CD117的表達對這些細胞做進一步的磁珠陽性分選。磁珠體積極小，不會對細胞造成機械性壓力，孵育時間短，操作過程快，磁性抗體和磁性標記物間的反應可在幾分鐘內(nèi)完成，從復雜的細胞混合物中分離出很高純度的細胞。

根據(jù)HSCs表達或不表達某些細胞表面分子，采用相應的熒光素標記抗體進行免疫染色，根據(jù)陽性、陰性選擇原理，應用流式細胞儀分選獲得具有某些細胞表面特征的細胞。本實驗采用流式細胞儀分析計數(shù)，免疫磁珠純化前小鼠骨髓CD117陽性細胞為(41.56±18.77)%，經(jīng)免疫磁珠純化后CD117陽性細胞百分比為(88.68±4.74)%，表明MACS是一種安全、有效并實用的分選HSCs CD117的方法，省時、簡便、純度高。

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篇6

關(guān)鍵詞 石英毛細管； 甲胎蛋白； 免疫分析； 灰度分析

1 引 言

隨著我國醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的快速發(fā)展和人們對健康保健的日益重視， 社會對實用性的檢測技術(shù)需求越來越多， 體外診斷的新方法、新技術(shù)已成為生物分析檢測的熱點和重點研發(fā)方向。目前， 低成本、操作簡便、小型化的體外診斷方法和裝備的研究正受到科研機構(gòu)和醫(yī)療檢測市場的廣泛關(guān)注。

現(xiàn)有的體外診斷產(chǎn)品中， 免疫檢測類產(chǎn)品占比很大， 主要采用酶聯(lián)免疫吸附法、化學發(fā)光法、電化學發(fā)光法、放射免疫法以及膠體金免疫層析法[1～3]。前兩者以微孔板為檢測載體， 技術(shù)較成熟， 但檢測時間較長， 一般需要2～3 h； 電化學發(fā)光法主要基于磁珠捕獲抗原進行檢測， 檢測速度快， 一般可在30 min內(nèi)完成， 但檢測成本較高， 約為酶聯(lián)免疫吸附法的3～4倍； 放射性免疫檢測靈敏度高， 但對操作環(huán)境及操作人員要求很高； 膠體金免疫層析檢測速度快， 可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測， 但難以實現(xiàn)定量分析。近年來， 一些學者報道了基于納米材料及微流控技術(shù)的新型體外免疫診斷方法， 但納米材料的制備較難控制其穩(wěn)定性， 真正實現(xiàn)臨床應用的并不多見[4，5]。本課題組多年從事毛細管電泳生物醫(yī)藥分析研究， 所用的分離載體是熔融石英毛細管， 其性質(zhì)穩(wěn)定， 透光性好， 表面易進行物理、化學修飾， 加工工藝成熟， 成本低廉[6～10]。本實驗將熔融石英毛細管用于免疫檢測的載體材料， 研究基于灰度值分析的血清中甲胎蛋白的免疫檢測方法， 目的是實現(xiàn)基于石英毛細管材料和灰度分析的定量免疫檢測。傳統(tǒng)的化學發(fā)光免疫分析檢測器大多采用光電倍增管， 檢測區(qū)域有限， 分析速度慢， 而以電感耦合器件（CCD）為代表的圖像傳感器則可以提供更加廣泛的檢測區(qū)域， 具有光電轉(zhuǎn)換效率高、動態(tài)線性范圍寬、多通道同時分析等優(yōu)點， 成為未來生物傳感器的一個發(fā)展方向[11，12]。實驗中使用的便攜式化學發(fā)光成像儀采用制冷CCD， 靈敏度高， 體積小， 僅有0.006 m3， 能夠高效捕獲化學發(fā)光信號， 形成圖片?；叶仁侵负诎讏D像中點的顏色深度， 灰度分析法具有結(jié)果直觀， 分析快速等優(yōu)點， 在生物學、醫(yī)學、圖像識別領(lǐng)域有廣泛的用途[13]， 很多體外診斷試劑的檢測應用也采用灰度值分析方法[14]。

本研究以熔融石英毛細管為載體， 建立了基于灰度分析的免疫檢測方法。以腫瘤標志物甲胎蛋白（AFP）為模型蛋白， 通過雙抗體夾心方式進行檢測， 與抗體偶聯(lián)的辣根過氧化物酶（HRP）催化化學發(fā)光底物液發(fā)光， 產(chǎn)生的光信號通過成像儀轉(zhuǎn)化為圖片[12，15，16]， 進行灰度值分析。研究結(jié)果表明， 毛細管免疫檢測和灰度分析結(jié)合， 實際使用的樣本量僅為0.8 μL， 而ELISA檢測一般需要50 μL， 因此本方法大幅降低了樣本使用量。檢測過程中僅需石英毛細管、醫(yī)用注射器等常用耗材， 操作簡單， 不依賴大型儀器。所建方法具有普適性， 可用于基于化學發(fā)光免疫分析的生物標志物的快速檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑：

便攜式化學發(fā)光成像儀（國家納米科學中心研制）； 熔融石英毛細管（北京華陽利民儀器有限公司）； 醫(yī)用注射器（北京科龍生物醫(yī)學技術(shù)有限公司）； 表面活化劑（美國Anteo Technologies公司）； 磷酸鹽緩沖液（PBS）和小牛血清白蛋白（BSA）（德國Merck公司）； AFP捕獲抗體、AFP的HRP酶標抗體及AFP標準液（北京科躍中楷生物技術(shù)有限公司）； 癌胚抗原（CEA）標準液、前列腺特異性抗原（PSA）標準液、糖類抗原125（CA125）標準液及糖類抗原199（CA199）標準液（北京沫之東生物技術(shù)有限公司）； 化學發(fā)光底物液（美國Millipore公司）； 實驗用水由Millipore純水儀制備。

2.2 分析方法

2.2.1 實驗操作步驟 實驗步驟如圖1所示：（1）活化毛細管 將毛細管裁剪為10 cm長， 使用醫(yī)用注射器將表面活化劑注入毛細管， 室溫靜置30 min， 對毛細管內(nèi)壁進行活化后， 用水沖洗。（2）固定捕獲抗體及封閉 將AFP的捕獲抗體按照一定比例用PBS稀釋， 將稀釋液注入毛細管內(nèi)部， 室溫靜置1 h后再用PBS清洗， 將含5% BSA的PBS溶液注入毛細管中， 室溫靜置30 min進行封閉。（3）注入待測蛋白 將待測蛋白AFP溶液注入到毛細管， 室溫孵育30 min后用PBS清洗。（4）注入酶標抗體及化學發(fā)光底物液 將稀釋為一定濃度的HRP酶標抗體注入毛細管， 室溫孵育30 min， PBS沖洗后注入化學發(fā)光底物液。

2.2.2 成像分析 將化學發(fā)光信號轉(zhuǎn)化為圖片形式， 進行成像灰度分析。毛細管置于成像儀中， 選擇一定的曝光時間， 檢測化學發(fā)光信號。毛細管中的化學發(fā)光底物在酶標抗體上HRP酶的催化作用下產(chǎn)生的光信號轉(zhuǎn)化為圖片。圖片上的灰度值表示待測蛋白AFP抗原的濃度。通過ImageJ軟件分析圖片， Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 毛細管內(nèi)徑對檢測的影響

市售毛細管有多種內(nèi)徑， 考察了不同內(nèi)徑毛細管對檢測的影響。毛細管內(nèi)徑不同， 可提供抗體結(jié)合的位點面積不同。內(nèi)徑較小的毛細管， 可節(jié)省樣品， 但內(nèi)壁表面積較小， 可吸附的捕獲抗體的量較小， 因而后續(xù)可結(jié)合的抗原以及酶標抗體也較少， 故化學發(fā)光信號較弱， 灰度低， 不利于靈敏檢測。較大內(nèi)徑的毛細管所提供的內(nèi)壁表面積大， 可吸附的捕獲抗體量增加， 可結(jié)合的抗原及酶標抗體也增加， 化學發(fā)光信號增強。考察了50， 75， 100， 150和200 μm內(nèi)徑的毛細管， 分別檢測相同濃度的AFP， 比較其灰度強度。結(jié)果表明， 灰度強度所指示的化學發(fā)光信號與AFP濃度呈正相關(guān)（圖2和圖3）?；叶日掌突叶葟姸染@示毛細管內(nèi)徑對AFP檢測有明顯影響。使用50 μm毛細管， 灰度強度較弱； 內(nèi)徑增加到75 μm， 灰度強度增大； 使用100 μm內(nèi)徑毛細管， 灰度較強且均勻； 當內(nèi)徑大于100 μm時， 信號強度降低， 且在橫截面方向上信號分布不均。理論上， 大內(nèi)徑的毛細管可提供的內(nèi)壁表面積大， 可吸附的捕獲抗體量多， 可結(jié)合的抗原及酶標抗體也多， 可使信號線性增強， 直至趨于飽和。然而由圖2可見， 150 μm內(nèi)徑時信號不均。 可能是由于與拍攝方向相切的內(nèi)壁上下沿區(qū)域光程較長， 出現(xiàn)內(nèi)壁上下沿信號較強， 中部信號偏弱的現(xiàn)象。灰度信號不均勻不利于準確分析， 且增加了各種試劑和樣品用量。因此， 實驗選擇內(nèi)徑100 μm的毛細管。

3.2 免疫分析的條件優(yōu)化

3.2.1 捕獲抗體濃度 捕獲抗體在毛細管內(nèi)的固定效果很大程度上決定了檢測的靈敏度。通常捕獲抗體在毛細管內(nèi)壁的密度越高， 檢測靈敏度越高， 但過高濃度的捕獲抗體， 會造成過飽和， 浪費抗體試劑。本實驗中， 固定AFP濃度和酶標抗體濃度， 對捕獲抗體濃度進行優(yōu)化， 將所購的捕獲抗體稀釋， 稀釋倍數(shù)為25， 50， 100， 150， 200， 250和300倍， 比較檢測的灰度值。當捕獲抗體的稀釋倍數(shù)為150， 200， 250和300倍時， 隨稀釋倍數(shù)增大， 溶液濃度降低， 灰度值即化學發(fā)光信號逐漸減小， 說明溶液中的捕獲抗體濃度偏低， 固定到毛細管內(nèi)壁的捕獲抗體量較少， 不能充分結(jié)合抗原， 故化學發(fā)光值隨稀釋倍數(shù)增大而降低， 灰度值減??； 當稀釋倍數(shù)為50和25倍時， 捕獲抗體的濃度因稀釋比例小而保持較高的水平， 但其化學發(fā)光信號卻與捕獲抗體稀釋100倍時相當， 并未增強， 說明當捕獲抗體稀釋倍數(shù)為100時， 灰度值即化學發(fā)光信號趨于飽和， 增加濃度不再使抗體在毛細管內(nèi)壁的分布密度增加， 且當稀釋倍數(shù)為100時， 結(jié)合到毛細管內(nèi)壁上的捕獲抗體能夠完全結(jié)合抗原。因此， 選擇稀釋100倍為捕獲抗體最佳的稀釋比例（圖4）。

3.2.2 酶標抗體溶度

酶標抗體的濃度也直接影響檢測結(jié)果。如果酶標抗體濃度偏低， 不能與抗原充分結(jié)合， 就會造成實際檢測信號值偏低。如果酶標抗體濃度偏高， 雖然反應充分， 但是可能浪費試劑。實驗中， 固定捕獲抗體稀釋倍數(shù)和AFP抗原濃度， 對檢測抗體濃度進行優(yōu)化。將所購的酶標抗體稀釋， 稀釋倍數(shù)為100， 150， 200， 250， 300和350倍， 比較不同稀釋濃度的灰度值。結(jié)果表明， 酶標抗體稀釋倍數(shù)為250， 300， 350倍時， 隨稀釋比例增大， 酶標抗體濃度降低， 灰度值即化學發(fā)光信號逐漸減小， 說明酶標抗體濃度偏低， 反應不充分； 稀釋倍數(shù)為150和100倍時， 酶標抗體濃度隨稀釋比例減小而增大， 但灰度值與稀釋倍數(shù)200時相比未見增加。說明稀釋倍數(shù)為200時， 灰度值趨于飽和， 抗原抗體結(jié)合較為充分。因此， 酶標抗體最佳的稀釋倍數(shù)為200倍。

3.2.3 孵育時間

孵育時間是免疫檢測的重要參數(shù)。如孵育時間過短， 反應進行不充分， 影響檢測的靈敏度。若孵育時間過長， 則耗時過長。本實驗對孵育時間進行優(yōu)化。室溫下， 將AFP抗原及AFP酶標抗體的孵育時間分別設(shè)定為5， 15， 30， 60和90 min， 比較灰度值變化。結(jié)果表明， 孵育15 min 的灰度值即化學發(fā)光信號比孵育5 min時明顯升高， 說明5和15 min的孵育時間偏短， 反應尚不充分； 孵育時間設(shè)為30， 60和90 min時， 灰度值沒有增加。說明孵育時間為30 min時， 灰度值趨于飽和， 免疫反應較為充分。因此， 選擇最佳孵育時間30 min（圖5）。

3.2.4 曝光時間優(yōu)化 曝光時間是化學發(fā)光免疫檢測的重要參數(shù)。曝光時間過長， 會造成高濃度AFP檢測信號過飽和； 曝光時間過短， 會造成低濃度AFP檢測信號微弱， 都不利于圖像分析， 因此有必要對曝光時間進行優(yōu)化。固定捕獲抗體及酶標抗體濃度， 對高濃度（100 ng/mL）和低濃度（3 ng/mL）的AFP分別進行檢測， 曝光時間為5， 10， 15， 20 和25 s， 選擇同時滿足高濃度和低濃度AFP抗原檢測的合適曝光時間。當曝光時間為15 s時， 3 ng/mL AFP抗原灰度值較弱， 無法進行圖像分析， 增加曝光時間， 灰度值增加。當曝光時間為25 s時， 100 ng/mL AFP抗原灰度值出現(xiàn)過飽和， 不利于分析。因此， 20 s為最佳曝光時間， 能夠滿足檢測需求。

3.3 灰度分析的標準曲線

選擇3.1～50 ng/mL濃度范圍的AFP樣品溶液， 測定其灰度值。 灰度值Y與AFP濃度X的關(guān)系為：

Y=

42.9328+53.8242log（X1.5625 ng/mL）2

式中， X的單位為ng/mL。Y與X二者呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系（圖6）， R=0.992。稀釋AFP樣品， 通過灰度分析， 測定方法的檢出限為2.7 ng/mL。

在目前的臨床檢驗中， 只有當AFP濃度超過20 ng/mL時， 該結(jié)果才具有一定的臨床診斷意義[17，18]。本方法對AFP的檢測范圍在3.1～50 ng/mL之間， 為進一步臨床應用奠定了基礎(chǔ)。

3.4 檢測特異性

特異性是評價免疫檢測的重要指標之一， 通常用交叉反應率表示。實驗中， 分別在血清加入中可能存在的干擾物CEA、 PSA、 CA125和CA199， 在最佳條件下測定。結(jié)果表明， 交叉反應率均小于0.5%， 說明上述潛在的干擾組分對檢測結(jié)果影響小， 方法的檢測特異性好[19]， 抗干擾能力強。

3.5 檢測準確性

評估體外診斷試劑準確性的方法主要有方法學比對和回收實驗兩種。方法學比對是將兩種不同的檢測體系所得結(jié)果進行比較， 在臨床化學文獻報道中較為常見[20～22]。將本方法與目前大型醫(yī)院廣泛使用的Roche電化學發(fā)光方法進行方法學比對。實際臨床樣本來源于總醫(yī)院， 使用采血管收集人全血， 在室溫中沉降30 min后， 3000 r/min離心5 min， 收集上層血清， 4℃儲存?zhèn)溆谩＋@取的20例血清樣本分別采用兩種方法進行分析檢測， 結(jié)果見圖7。兩種方法的線性回歸方程為y=0.148+11095x， R=0.980， 說明兩種方法的相關(guān)性良好， 本方法具有較高準確性， 能夠滿足臨床檢測要求。通過回收實驗評價本方法的準確性。選用3份人血清， 在最佳實驗條件下測定其AFP濃度， 然后分別向血清中加入AFP標準液， 再次測定其AFP濃度。重復5次， 計算得回收率在96.0%～106.7%之間（表1）， 說明本檢測方法的準確性較好[20]。

4 結(jié) 論

以熔融石英毛細管為免疫分析載體材料， 通過化學發(fā)光成像和灰度分析， 建立了血清甲胎蛋白的定量免疫分析檢測方法。本方法可在3.1～50 ng/mL 濃度范圍實現(xiàn)甲胎蛋白檢測， 覆蓋了臨床應用的關(guān)鍵濃度， 為本方法的進一步臨床應用奠定了基礎(chǔ)?；诿毠転檩d體的灰度分析免疫檢測方法的樣本消耗少、載體材料簡單、檢測成本低廉， 且不依賴大型儀器， 適用化學發(fā)光免疫分析， 具有普適性和較好的臨床檢驗應用前景。

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篇7

【關(guān)鍵詞】血管緊張素Ⅰ 固相抗體法 放射免疫分析

1引言

采用固相抗體包被聚苯乙烯試管，并對抗體包被條件進行了研究，建立了血管緊張素Ⅰ放射免疫分析法。結(jié)果表明在2―8℃下過夜包被，抗體滴度在1：9萬 時，制備的包被管用于血管緊張素Ⅰ放射免疫分析，結(jié)合達到最大；不同滴度下包被，包被溫度和時間對制備的包被管的影響不同；不同的反應時間以及125I―AI和標準品加樣量的不同也會對包被管的結(jié)合產(chǎn)生影響。血管緊張素Ⅰ包被管法放射免疫分析靈敏度為（42.2Pg/ml）；回收率為（90.3%―102.2%）；批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為（5.1%―9.0%）和（8.3%―10.2%）。

2實驗材料

血管緊張素Ⅰ多克隆抗體由原子高科醫(yī)學二部提供；聚苯乙烯六角試管（mm×mm）為（哪個）塑料廠產(chǎn)品；125I―AI及AI藥盒標準品由原子高科醫(yī)學二部提供；蛋白G填料親合層析柱由美國進口；牛血清白蛋白（BSA）為上海生物制品廠產(chǎn)品。對照藥盒由原子高科股份有限公司生產(chǎn)（國藥準字：）。其他試劑均為分析純。

3實驗方法

3.1兔IgG的純化

采用蛋白―G柱進行親合層析純化，純化后IgG濃度由紫外分光光度法測定。

用包被緩沖液（0.1M PH9.5碳酸緩沖液）將兔IgG配制10μg /ml?；旌暇鶆蚝?50？L /管包被，然后放2―8℃過夜，棄去包被管中第一層包被液，各管用500？L洗滌液（0.02 mol/L，pH7.4磷酸緩沖液）清洗1次。待包被第二層（兔二抗）用。

3.2用驢抗兔二抗進行第二層包被

用0.05 mol/L，pH7.4磷酸緩沖液（含1%BSA）將兔二抗配成合適的濃度后250？L /管包被，然后放2―8℃過夜，棄去包被管中第二層包被液，各管用500？L洗滌液（0.02 mol/L，pH7.4磷酸緩沖液）清洗1次。待包被第三層（兔一抗）用。

3.3不同滴度兔抗（一抗）包被實驗

將兔抗用封閉液配制成1：2萬，1：4萬，1：6萬，1：8萬，1：9萬，1：12萬，1：14萬，1：16萬不同的滴度，分別加250？L于已經(jīng)包有兔二抗的包被管中，每個滴度做雙復管，之后在每管中加入100？L 125I―AI，然后放2―8℃靜置過夜；棄去管中溶液，各管用500？L洗滌液清洗3次后測量各管放射性計數(shù)，計算其結(jié)合率，選擇合適的抗體滴度作為工作稀釋度。

3.4溫度，時間對抗體包被的影響

用封閉液將兔抗（一抗）稀釋成不同滴度（1：2萬，1：4萬， 1：8萬，1：9萬，1：12萬，1：14萬），分別在不同溫度和時間下包被，實驗中抗體加入體積均為250？L，各管均加入100？L 125I―AI，將不同條件下制備的包被管進行放射免疫結(jié)合分析，并對結(jié)果進行比較。

3.5抗體包被管的制備

每管加250？L兔IgG溶液（10μg /ml），2―8℃靜置過夜，棄溶液，各管加500？L洗滌液清洗1次后加入250？L驢抗兔二抗溶液，2―8℃靜置過夜，棄溶液，各管加500？L洗滌液清洗1次后加入250？L兔一抗溶液（1：9萬），2―8℃過夜，棄溶液，各管加500？L洗滌液清洗1次，棄溶液，自然晾干，密閉，于2―8℃下保存。

3.6體系反應時間，溫度的選擇

設(shè)計不同的反應條件為37℃1h，37℃3h，4℃15h，4℃24h。

3.7加樣量的選擇

設(shè)計4組不同的加樣量為：第一組125I―AI加100？L，標準品加100？L；第二組：125I―AI加100？L，標準品加50？L；第三組125I―AI加50？L，標準品加100？L；第四組125I―AI加50？L，標準品加50？L。

3.8放射免疫分析程序

標準品（或樣品、質(zhì)控血清）100？L和標記物100？L加于包被管中，混勻，然后放2―8℃靜置過夜（15―24h），棄溶液，加500？L洗滌液清洗2―3次，測各管放射性計數(shù)。

3.9方法學考核

靈敏度：以20個零標準管的計數(shù)平均值―2S對應的劑量值表示。準確度：任取一份血漿標本，測定基值后分別加入0pg/ml ，250pg/ml，625 pg/ml，1560 pg/ml的標準品，再次測定，計算回收率。精密度：測定批內(nèi)和批間變異系數(shù)（CV%）。健全性：將一份高濃度樣品稀釋成1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64分別測定其含量。經(jīng)回歸處理后成一條直線，y=1.000 x +0.4673，r=1.000。

4結(jié)果與討論

4.1不同滴度的兔抗（一抗）包被實驗

不同滴度抗體包被實驗結(jié)果列于表1，表1結(jié)果表明，當抗體滴度為1：16萬―1：8萬時，隨著抗體滴度的減小，包被管的結(jié)合率逐步升高；當抗體滴度為1：8萬―1：2萬時，包被管的結(jié)合率沒有出現(xiàn)明顯升高，基本保持同一水平。所以在不影響放免藥盒靈敏度的前提下，選擇1：9萬作為抗體的工作稀釋度，用于包被。（該處可以作圖，不列表）

4.2包被時間，包被溫度對包被的影響

結(jié)果列于表2由表2可知，包被溫度和包被時間對包被管免疫結(jié)合的影響依賴于包被時加入抗體的濃度。當加入抗體的滴度為1：2萬和1：4萬時，升高包被溫度使包被管的免疫結(jié)合增加，而延長包被時間對包被管的免疫結(jié)合無顯著影響；當加入抗體滴度為1：14萬

和1：16萬時，升高包被溫度包被管的免疫結(jié)合顯著減少，原因可能是抗體在低濃度時較不穩(wěn)定，包被過程中較高的溫度使抗體的活性損失；當加入抗體滴度為1：8萬和1：9萬時，包被溫度對包被管的免疫結(jié)合影響減少，且包被時間從3h延長到24h，包被管的免疫結(jié)合有所增加。此結(jié)果提示，在較高溫度下，采用較大抗體濃度，只需要較短的包被時間，即可獲得具有較高免疫結(jié)合的抗體包被管。但考慮到實際生產(chǎn)中低成本和包被工藝簡便性的需要，在滿足免疫分析要求的前提下，選擇抗體滴度為1：9萬，2―8℃過夜（15―24h）作為包被條件。

4.3體系反應時間、反應溫度的選擇

結(jié)果列于表3，由表3可知，當反應溫度在37℃時，延長反應時間從1 h到3 h，免疫分析的最大結(jié)合S0%從46.4%增加到59.2%，但是標準曲線的最高濃度點的抑制不好，分別為37℃1 h為16.1%；37℃3 h為14.6%，這可能是反應不充分造成的。而反應溫度在2―8℃時，延長反應時間從15―24h，免疫反應的幾個指標都比較好，同時也克服了37℃反應曲線抑制不好的問題，所以在考慮實際操作簡便，節(jié)省時間的需要，在滿足免疫分析要求的前提下，選擇反應條件為2―8℃過夜。

4.4加樣量對免疫分析的影響

結(jié)果列于表4由表4可知，當加入標記物的量都是50？L時，加入100？L標準品的包被管的免疫分析主要指標最大結(jié)合S0%，曲線的抑制都好于加入50？L標準品的包被管免疫分析主要指標，加50？L標準品的包被管的曲線抑制不好，標準曲線最低濃度點的B/B0%為94.1%，最高濃度點的B/B0%為14.6%。但是考慮到加50？L標記物的各管計數(shù)都比較低，還有計數(shù)器的效率等問題，所以標記物的加樣量就不采用50？L加樣。當加入標記物的量都是100？L時，加入100？L標準品的包被管的免疫分析主要指標最大結(jié)合S0%，曲線的抑制都很好，并且各管的放射性計數(shù)也比較高，各種因素對測量的影響也相對較小。當加入50？L標準品時，標準曲線出現(xiàn)倒勾現(xiàn)象，曲線的最低濃度點B/B0%為101%，出現(xiàn)這種情況就是因為標準曲線的各包被管中加入 的非標記抗原的量不夠造成的。所以通過對數(shù)據(jù)的比較，選擇比較合適的加樣量為標記物加100？L，標準品加100？L。

4.6方法學鑒定

（1）靈敏度。以20個零標準管計數(shù)的平均值-2S對應的劑量值表示，靈敏度為（42.2Pg /ml）pg/ml。

（2）準確度 已知量的一份血漿樣品中分別加入4種不同劑量的標準品進行測定，結(jié)果列于表5。由表5可知本法回收率為90.3%―102.2%，說明本法準確性較好。

（3）精密度

采用本方法對3份含有不同濃度的人血漿樣品重復測定，計算批內(nèi)、批間變異系數(shù)，結(jié)果列于表6。由表6可知，批內(nèi)變異系數(shù)為（5.1%―9.0%）；批間變異系數(shù)為（8.3%―9.5%）。

（4）健全性（同質(zhì)性）。將一份較高濃度的血漿樣品倍比稀釋成1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64，測定結(jié)果列于表7。由表中數(shù)據(jù)計算其相關(guān)方程為：y=1.000 x +0.4673，r=1.000

實驗結(jié)果表明研制的血管緊張素Ⅰ放射免疫分析法（固相抗體法）的健全性良好。

5結(jié)語

（1）采用 固相抗體 包被聚苯乙烯試管的包被條件為：選擇抗體滴度為1：9萬，2―8℃過夜（15―24h）。在此條件下所得包被管用于血管緊張素Ⅰ放射免疫分析，可達到最大結(jié)合。

（2）用該包被管進行血管緊張素Ⅰ放射免疫分析時，其靈敏度為（42.2Pg /ml）；回收率為（90.3%―102.2%）；批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為（5.1%―90%）和（8.3%―10.2%）。

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篇8

[關(guān)鍵詞]　共詞分析　專利引文分析　知識關(guān)聯(lián)

[分類號]　G255.53

1　科學―技術(shù)知識關(guān)聯(lián)的概念

“科學―技術(shù)知識關(guān)聯(lián)”是近年來專利計量學領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容之一，在Scientometrics、World PatentInformation等權(quán)威期刊的相關(guān)文獻中通常被表述為Science Technology Linkage、Science Technology Interac-tion、Science Dependence of Technology。研究科學一技術(shù)知識關(guān)聯(lián)的意義在于：通過揭示哪些基礎(chǔ)研究學科與哪些技術(shù)發(fā)明領(lǐng)域之間存在知識關(guān)聯(lián)，預見二者間可能的推動或啟示作用，從而為國家創(chuàng)新體系的管理者提供科技資源配置方面的決策參考，以便目標明確地扶持更具產(chǎn)出能力的基礎(chǔ)學科，發(fā)掘已具備基礎(chǔ)儲備的未來技術(shù)創(chuàng)新領(lǐng)域。

2　揭示科學一技術(shù)知識關(guān)聯(lián)的各種途徑和方法

目前，揭示科學一技術(shù)知識關(guān)聯(lián)的途徑多種多樣，不同學科都在為此作出各自的貢獻。

在科學社會學和技術(shù)社會學視野下，研究公共基礎(chǔ)研究機構(gòu)(公共科研院所、研究型大學、國家重點實驗室)與企業(yè)的合作研發(fā)活動，是揭示科學一技術(shù)知識關(guān)聯(lián)的有效途徑。技術(shù)社會學認為，公共基礎(chǔ)研究是技術(shù)變遷過程的基本要素，它通過提高社會整體創(chuàng)新水平間接推動企業(yè)的開發(fā)活動?？茖W社會學的雙螺旋理論(Double Helix Model)認為，科學與技術(shù)是一對舞者(a pair of dancer)的關(guān)系，二者在相互推動下呈螺旋狀上升發(fā)展?；A(chǔ)研究與技術(shù)開發(fā)之間的知識交互過程和合作活動是實現(xiàn)技術(shù)突破的能量儲備過程，是實現(xiàn)技術(shù)躍遷的重要前提。文獻[1―3]通過統(tǒng)計大學及公共基礎(chǔ)研究機構(gòu)與企業(yè)的合作研發(fā)活動，揭示了激光、分子生物學等領(lǐng)域的科學一技術(shù)知識關(guān)聯(lián)、知識擴散和成果應用情況。

在技術(shù)經(jīng)濟學視野下，挖掘基礎(chǔ)科研機構(gòu)和技術(shù)開發(fā)機構(gòu)(各類企業(yè))在地理空間分布上所表現(xiàn)出的關(guān)聯(lián)規(guī)則，是揭示科學一技術(shù)知識關(guān)聯(lián)的又一途徑。技術(shù)經(jīng)濟學認為，區(qū)域經(jīng)濟管理者在制定科技政策時，通常會從有利于本地經(jīng)濟和技術(shù)發(fā)展的角度出發(fā)，利用基礎(chǔ)科研對本地技術(shù)創(chuàng)新的影響，在同一地域范圍內(nèi)統(tǒng)籌規(guī)劃創(chuàng)新型企業(yè)和基礎(chǔ)科研機構(gòu)，從而構(gòu)建起兩者間知識關(guān)聯(lián)和轉(zhuǎn)移的通道?；谏鲜黾夹g(shù)經(jīng)濟基礎(chǔ)，基礎(chǔ)科研機構(gòu)和企業(yè)的地理鄰近性與兩者間的知識關(guān)聯(lián)和轉(zhuǎn)移強度之間通常會表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。文獻[4―6]分別通過研究美國、法國、東歐范圍內(nèi)基礎(chǔ)科研機構(gòu)和創(chuàng)新型企業(yè)的地理空間凝聚現(xiàn)象，揭示了對應的科學一技術(shù)知識關(guān)聯(lián)和知識轉(zhuǎn)移強度。

在科學計量學和文獻計量學視野下，解析科研期刊論文與技術(shù)專利文獻間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，也是揭示科學一技術(shù)知識關(guān)聯(lián)的另一途徑?？茖W計量學家Verbeek認為，企業(yè)創(chuàng)新人員對科研文獻的理解、認同和利用是引發(fā)科學一技術(shù)知識關(guān)聯(lián)和最終造就技術(shù)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Garfield指出，發(fā)明不可能來源于魔術(shù)或真空，它是發(fā)明人對若干已有的概念進行重新組合的知識成果。Narin等認為，幾乎所有的科技成果都是在前人工作的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，知識的關(guān)聯(lián)性在專利引文中有著明顯的體現(xiàn)?？蒲衅诳撐呐c技術(shù)專利文獻之間的共詞關(guān)系和引用關(guān)系是新知識向技術(shù)部門轉(zhuǎn)移的顯性表現(xiàn)。

3　利用共詞分析法揭示科學一技術(shù)知識關(guān)聯(lián)的局限

共詞分析法以某一(或一系列)主題檢索詞(科學概念或技術(shù)術(shù)語)為“關(guān)聯(lián)點”，分析該詞在科研論文和專利說明書中的“共現(xiàn)”情況，從而推理和判斷基礎(chǔ)科學學科與技術(shù)創(chuàng)新領(lǐng)域之間關(guān)聯(lián)關(guān)系的方法。共詞分析法直觀、有效，但同時也存在著明顯的問題和局限。

3.1　科學概念與技術(shù)術(shù)語之間存在部分不對應問題

盡管INSPEC和INPADOCDB等詞表能夠提供某一科學概念和技術(shù)術(shù)語的多種詞匯表達，但它們不能解決“部分科學概念與技術(shù)術(shù)語不對應”的基本矛盾。例如：專利說明書中的技術(shù)術(shù)語thin film(納米絕緣薄膜)及其同義術(shù)語ion sol-gel(離子溶膠凝膠)、polyerys-talline film(硅多晶薄膜)等在科研論文中并沒有絕對對應的概念，通常只能被近似地映射為chemical vapordeposition(化學氣相沉積)、carbon nanotubes(納米碳管)、amorphous nitride(無定形氮化膜)等詞匯形式。

3.2　同一概念術(shù)語在科研論文和技術(shù)專利中的表達方式各不相同

科研論文中的化合物名稱在專利說明書中往往以分子式、化學鍵結(jié)構(gòu)式或馬庫什結(jié)構(gòu)式(Mm-kush strue-ture)表示，例如，pantoprazole作為一種常用的抗?jié)兯幬锏幕瘜W名稱常出現(xiàn)在科研論文中，但在專利說明書中這一詞匯很少出現(xiàn)，取而代之的是其馬庫什結(jié)構(gòu)式，如圖1所示：

3.3　專利技術(shù)的核心特征詞難以被確定

科研論文由作者給出關(guān)鍵詞，指明論文的核心知識概念，但專利說明書中沒有“關(guān)鍵詞”，發(fā)明人沒有歸結(jié)出專利的核心技術(shù)特征。目前的共詞分析主要依據(jù)“詞頻”和詞出現(xiàn)在專利說明書中的“位置”來間接推斷某術(shù)語是否表達了技術(shù)的核心特征。但核心特征詞的“詞頻”的分布閾值和詞出現(xiàn)在專利說明書中的什么“位置”能否代表技術(shù)的核心特征也還是一個爭論性話題，如有人重視“標題”、“摘要”位置，也有人重視“權(quán)利要求條款”位置。

3.4　語種差異有時會引發(fā)技術(shù)術(shù)語缺失

例如，中國專利中的中醫(yī)治療方法專利和中藥配方專利所涉及的人體穴位和草藥名稱等都沒有對應的英語詞匯。

目前，上述問題都還沒有有效的解決方案，這就局限著共詞分析法在揭示科學一技術(shù)知識關(guān)聯(lián)方面的效度和信度。

4　利用專利引文揭示科學一技術(shù)知識關(guān)聯(lián)的優(yōu)勢

本文所討論的專利引文主要是指專利說明書所引證的相關(guān)科研期刊論文。Jaffe等將“專利引文分析法”(patent citation analysis)定義為：利用各種數(shù)學與統(tǒng)計學的方法，對專利引文進行分析并揭示其中存在的數(shù)量特征和內(nèi)在規(guī)律的方法。1994年Narin首創(chuàng)了“專利計量學”(Patentbibliometric)并構(gòu)建了專利計量指標(Science Linkage，sL)，用以度量技術(shù)發(fā)明與基礎(chǔ)研究之間的關(guān)聯(lián)強度。利用專利引文揭示科學一技術(shù)知識關(guān)聯(lián)的方法，以專利引文為紐帶，通過專利說明書對科研期刊論文的引證映射，揭示對應的基礎(chǔ)研究學科與技術(shù)創(chuàng)新領(lǐng)域之間的知識關(guān)聯(lián)，其基本原理如圖2所示：

篇9

關(guān)鍵詞：食品 分析 檢驗 方法

食品是人類生存不可缺少的物質(zhì)條件之一，是人類進行一切生命活動的能源。因此，食品品質(zhì)的好壞直接關(guān)系著人們的身體健康。食品分析與檢驗就是研究和評定食品品質(zhì)及其變化的一門專業(yè)性很強的實驗科學。它依據(jù)物理、化學、生物化學的一些基本理論和國家食品安全標準。運用現(xiàn)代科學技術(shù)和分析手段，對各類食品（包括原料、輔助材料、半成品及成品）的主要成分及其含量和有關(guān)工藝參數(shù)進行檢測，以保證生產(chǎn)出質(zhì)量合格的產(chǎn)品。

1.感官檢驗法

感官檢驗作為食品檢驗的重要方法之一，具有簡便易行、快速靈敏、不需要特殊器材等特點，特別適用于目前還不能用儀器定量評價的某些食品特性的檢驗，如水果滋味的檢驗、食品風味的檢驗以及煙、酒、茶的氣味檢驗等。

依據(jù)所使用的感覺器官的不同，感官檢驗可分為視覺檢驗、嗅覺檢驗、味覺檢驗、觸覺檢驗和聽覺檢驗五種。

感官分析法存在一定缺陷，由于感官分析是以經(jīng)過培訓的評價員的感覺器官作為一種"儀器"來測定食品的質(zhì)量特性或鑒別產(chǎn)品之間的差異的，因此，判斷的準確性與檢驗者的感覺器官的敏銳程度和實踐經(jīng)驗密切相關(guān)。同時檢驗者的主觀因素（如健康狀況、生活習慣、文化素養(yǎng)、情緒等），以及環(huán)境條件（如光線、聲響等）都會對鑒定的結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。另外，感官檢驗的結(jié)果大多數(shù)情況下只能用比較性的用詞（優(yōu)良、中、劣等）表示或用文字表述，很難給出食品品質(zhì)優(yōu)劣程度的確切數(shù)字。

感官檢驗是與儀器檢驗并行的重要的檢測手段，其重要性不僅在于有些產(chǎn)品的特性目前還不能用儀器檢驗，只能靠感官，即使能夠得到先進的測量儀器，感官檢驗的重要性也不隨之降低，因為感官指標與理化指標是互相補充的，只有儀器分析與感官分析相結(jié)合才能得到產(chǎn)品的完整信息。因此，感官檢驗法是食品重要的分析手段之一。

2.物理分析法

通過對被測食品的某些物理性質(zhì)（如溫度、密度、折射率、旋光度、沸點、透明度等）的測定，可間接求出食品中某種成分的含量，進而判斷被檢食品的純度和品質(zhì)。

物理分析法簡便、實用，在實際工作中應用廣泛。如密度法可測定糖液的濃度、酒中酒精含量，檢驗牛奶是否摻水、脫脂等等；折光法可測定果汁、番茄制品、蜂蜜、糖漿等食品的固形物含量，牛乳中乳糖含量等；旋光法可測定飲料中蔗糖含量、谷類食品中淀粉含量等。

3.物理化學分析法

物理化學分析法是通過測量物質(zhì)的光學性質(zhì)、電化學性質(zhì)等物理化學性質(zhì)來求出被測組分含量的方法。它包括光學分析法、電化學分析法、色譜分析法、質(zhì)譜分析法和光電化學分析法等，食品分析與檢驗中常用的是前三種方法。光學分析法又分為紫外-可見分光光度法、原子吸收分光光度法、熒光分析法等，可用于分析食品中無機元素、碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、食品添加劑、維生素等成分。電化學分析法又分為電導分析法、電位分析（離子選擇電極）法、極譜分析法等。電導分析法可測定糖品灰分和水的純度等；電位分析法廣泛應用于測定pH、無機元素、酸根、食品添加劑等；極譜分析法已應用于測定重金屬、維生素、食品添加劑等，這些方法解決了一些食品的前處理和干擾問題。色譜法是近些年迅速發(fā)展起來的一種分析技術(shù)，極大地豐富了食品分析與檢驗的內(nèi)容，解決了許多常規(guī)化學分析法不能解決的微量成分分析的難題，為食品分析與檢驗技術(shù)開辟了新途徑。色譜法包含許多分支，食品分析與檢驗中常用的是薄層層析法、氣相色譜法和高效液相色譜法，可用于測定有機酸、氨基酸、糖類、維生素、食品添加劑、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。

人們常將物理分析法和物理化學分析法歸結(jié)為儀器分析法，即指以物質(zhì)的物理或物理化學性質(zhì)為基礎(chǔ)，利用光電儀器來測定物質(zhì)含量的方法。儀器分析法具有靈敏、快速、操作簡單、易于實現(xiàn)自動化等優(yōu)點。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，儀器分析法已越來越廣泛地應用于食品分析與檢驗中。

4.化學分析法

化學分析法包括定性分析和定量分析兩部分。但對于食品分析與檢驗來說，由于大多數(shù)食品的來源及主要成分是已知的，一般不必作定性分析，僅在個別情況下才作定性分析。因^此，最經(jīng)常的工作是定量分析?；瘜W定量分析法包括重量法和容量法，食品中水分、灰分、脂肪、果膠、纖維等成分的測定，常規(guī)方法都是重量法。容量法又包括酸堿滴定法、氧化還原滴定法、配合滴定法和沉淀滴定法四種，其中前兩種最常用，如酸度、蛋白質(zhì)的測定用到酸堿滴定法，還原糖、維生素0的測定用到氧化還原滴定法。

化學分析法是食品分析與檢驗的基礎(chǔ)。即使是現(xiàn)代的儀器分析，也都是用化學方法對樣品進行預處理及制備，而且儀器分析的原理大多數(shù)也是建立在化學分析的基礎(chǔ)上的。為檢驗儀器分析的準確度和精確度，還需用規(guī)定的或推薦的化學分析標準方法作對照，以確定兩種方法分析結(jié)果的符合程度。因此，化學分析法是食品分析與檢驗最基本的、最重要的分析方法。食品中大多數(shù)成分的分析都可以靠化學分析法完成。

5.生物分析法

目前，應用于食品分析與檢驗中的生物分析法主要包括微生物分析法與PCR技術(shù)的應用等。

微生物分析法是基于某些微生物生長需要特定的物質(zhì)來進行分析的，方法條件溫和，克服了化學分析法和儀器分析法中某些被測成分易分解的弱點，此方法的選擇性也高。此法廣泛應用于維生素、抗生素殘留量、激素等類物質(zhì)的分析中。聚合酶鏈式反應是一種分子生物學技術(shù)，用于放大特定的DN段，然后采用電泳法或熒光探針檢測食品中致病菌或用于轉(zhuǎn)基因食品的檢測。

6.生物化學分析法

酶分析法是目前應用得比較多的一種生物化學分析法。

酶分析法是利用酶的反應對物質(zhì)進行定性、定量的方法。酶是生物催化劑，它具有高效和專一的催化特性，而且可在溫和的條件下進行催化。酶作為分析試劑應用于食品分析與檢驗中，可從復雜的組分中檢測某一成分而不受或很少受其他共存成分干擾，具有簡便、快速、準確、靈敏等優(yōu)點。目前已應用于食品中有機酸、糖類、淀粉、維生素等成分的測定。

此外，食品分析方法還包括綜合了分子生物學、免疫學、微電子學、微機械學、化學、物理、計算機等多項技術(shù)的生物芯片技術(shù)等。

參考文獻

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[3]高向陽.食品分析與檢驗.北京：中國計量出版社，2006

篇10

【摘要】 目的 探討早發(fā)冠心病血瘀證、痰濁證面部光電血流容積特征及與一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET)含量的關(guān)系。方法 早發(fā)冠心病血瘀證36例，痰濁證35例，健康對照組31例，采用GD-3型光電血流容積面診儀檢測光電血流容積參數(shù)，硝酸還原酶法測定NO，放射免疫分析法測定ET。結(jié)果 血瘀證患者Hb、He、Hf、Hb/Tab、Hf/Hb較正常組顯著降低(P＜0.01)，痰濁證患者Hb、He、Hf及Hf/Hb較正常組顯著降低(P＜0.01)，血瘀證患者與痰濁證患者比較，Hb、Hb/Tab顯著降低(P＜0.01)。3組間Hb、ET、NO比較：血瘀證組Hb最小，痰濁證組次之，正常組最高；而ET含量各組間無統(tǒng)計學意義；NO含量血瘀證組低于正常組(P＜0.01)；隨著光電血流容積主波幅的增高，ET均數(shù)值逐漸下降，NO均數(shù)值逐漸上升，低波幅組與高波幅組差異有統(tǒng)計學意義。ET與Hb成負相關(guān)，NO則呈正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論 心臟功能減退與大動脈順應性降低是本證基本病理改變之一。血流容積主波幅與NO、ET含量具備相關(guān)關(guān)系，從而準確反映血管的舒縮狀態(tài)及體內(nèi)生物活性物質(zhì)的變化，三者可作為早發(fā)冠心病血瘀證、痰濁證輔助診斷指標之一。

【關(guān)鍵詞】 早發(fā)冠心??；血瘀證；痰濁證；光電血流容積；一氧化氮；內(nèi)皮素

Abstract：Objective To research photoelectric facial blood flow volume characteristic of premature coronary heart disease of heart blood stasis syndrome (HBSS) and phlegm syndrome (PS)， and its relation with NO and ET. Methods Patients of premature coronary heart disease of HBSS (36 cases) and PS (35 cases) were selected， with 31 health people as control. The parameter of photoelectric facial blood flow volume was detected with GD-3 photoelectric blood stream plethysm (PBSP) of the facial color-diagnosis. NO was determined by nitrate reductase method and ET was determined by RIA. Results Hb， He， Hf， Hb/Tab and Hf/Hb of HBSS decreased obviously compared with the control (P＜0.01). Hb， He， Hf and Hf/Hb of PS decreased obviously compared with the control (P＜0.01). Hb， Hb/Tab of HBSS decreased obviously compared with PS (P＜0.01). Comparison of Hb， ET， NO among the three groups was as follows：Hb of HBSS was the lowest， followed by PS， the highest was the control. There was no significance in the content of ET among the three groups， the content of NO in HBSS was lower than the control (P＜0.01). With the main volume of PBSP flow increased， ET values gradually declined， NO values gradually rose， there was significantly different between low amplitude group and high amplitude group. ET and Hb correlated negatively， NO and Hb correlated positively. Conclusion It is one of the basic pathological changes of the syndrome that cardiac function and artery compliance reduced. There were correlationship between the main volume of PBSP and content of NO and ET， so the systolic and diastolic blood vessels in the body and the state of bio-active substances can be accurally responsed. All those can be used as the auxiliary diagnostic indexes of premature coronary heart disease HBSS and PS.

Key words：premature coronary heart disease；heart blood stasis syndrome；phlegm syndrome；photoelectric blood stream plethysm；nitrogen monoxide；endothelin

血管內(nèi)皮細胞釋放的主要內(nèi)分泌因子內(nèi)皮素(ET)與一氧化氮(NO)是一對具有拮抗效應的血管活性物質(zhì)。ET是內(nèi)源性收縮因子中研究最多、且是最強的血管收縮劑之一[1]，而NO作為內(nèi)皮源性舒張因子[2]，具有極強的舒張血管的作用。在生理情況下，NO/ET水平保持動態(tài)平衡；病理情況下，其平衡遭到破壞，導致血管舒縮功能紊亂，血管內(nèi)皮受損及通透性改變，血液流變學異常，引發(fā)痰濁閉塞、瘀阻血絡(luò)，最終導致冠心病。因此，通過檢測早發(fā)冠心病血瘀證與痰濁證的光電血流容積指標，探討其與NO、ET含量的相關(guān)性及臨床診斷價值，具有重要意義[3]。

1 資料與方法

1.1 觀察對象

健康對照組31例，參照WHO確定健康的定義與10項標準[4]，平均年齡(55.07±7.19)歲；其中男11例，女20例，經(jīng)病史調(diào)查、體格檢查和必要的理化檢查，皆證實為健康人。冠心病血瘀證36例，痰濁證35例，冠心病診斷參照1979年國際心臟病學會和WHO臨床命名標準化聯(lián)合專題報告[5]及第一屆全國內(nèi)科學術(shù)會議心血管病專業(yè)組(1980年12月，廣州)關(guān)于冠心病命名及診斷標準的建議[6]；中醫(yī)辨證分型標準參照2002年國家中醫(yī)藥管理局醫(yī)政司胸痹急癥組、中國中醫(yī)藥學會內(nèi)科學會心病專業(yè)委員會《中醫(yī)心病診斷療效標準與用藥規(guī)范》[7]。血瘀證患者平均年齡(56.32±7.35)歲，男20例，女16例；痰濁證患者平均年齡(57.24±7.46)歲，男21例，女14例。3組觀察對象男性年齡均＜55歲，女性年齡均＜65歲。經(jīng)病史調(diào)查、心電圖、實驗室相關(guān)檢查、臨床病癥舌脈象，均確診為早發(fā)冠心病血瘀證與痰濁證患者。組間性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

1.2 檢測指標及方法

1.2.1 面部光電血流容積圖檢測

應用湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷研究所研制的GD-3型光電血流容積面診儀，與Pclab生物機能信號采集系統(tǒng)匹配，Pclab系統(tǒng)采用動物心電(mV)、三通道(CH3、壓縮比為20)、低通濾波(10 Hz)，記錄面頰部光電血流容積圖。被檢者采取仰臥位，自然放松，用95%的酒精棉球在檢測部位脫脂后，將光電換能器探頭緊貼檢測部位，中等壓力，以不漏光為佳。按步驟在計算機Pclab軟件中測量波形時間指標(Tag、Tab、Tae、Teg、Tw)、波幅指標(Hb、Hd、He、Hf)，再計算比值指標(Hb/Tab、Hd/Hb、He/Hb、Hf/Hb等)[8]。

1.2.2 血漿一氧化氮和內(nèi)皮素測定

采用北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司血漿ET放射免疫藥盒(放射免疫分析法)測定ET，采用南京建成生物工程研究所NO試劑盒(硝酸還原酶法)測定NO。按試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學方法

檢測值用x±s表示，3組間兩兩比較用單因素方差分析，各因素之間關(guān)系用直線相關(guān)分析。所有資料用SPSS 14.0版統(tǒng)計軟件在計算機上完成。

2 結(jié)果

2.1 3組間光電血流容積主波幅、內(nèi)皮素、一氧化氮的比較

在不同的證型之間，光電血流容積主波幅(Hb)比較差異具有統(tǒng)計學意義，其中血瘀證組波幅最小，痰濁證組次之，正常組最高；而ET含量變化各組間無統(tǒng)計學意義，NO含量血瘀證組低于正常組，二者差異有統(tǒng)計學意義，血瘀證組與痰濁證組比較差異無統(tǒng)計學意義。見表1。表1 3組間ET、NO含量與光電血流容積Hb的比較(略)注：與血瘀證比較，*P＜0.01；與痰濁證比較，#P＜0.01；與正常組

比較，P＜0.01

2.2 不同光電血流容積主波幅組內(nèi)皮素和一氧化氮含量的變化

在不考慮證的前提下，根據(jù)光電容積主波幅的高低將其分為6組(A、B、C、D、E、F組)，可以看出，隨著光電血流容積主波幅的增高，ET均數(shù)值逐漸下降，NO均數(shù)值逐漸上升，低波幅組與高波幅組差異有統(tǒng)計學意義。NO的變化與ET相反，各組間差異有統(tǒng)計學意義。見表2。表2 不同光電血流容積主波幅組內(nèi)ET和NO含量的變化(略)注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比較，#P＜0.05；

與C組比較，P＜0.05；與D組比較，P＜0.05

2.3 面部光電血流容積波幅與比值指標的比較

血瘀證患者與正常組比較，Hb、He、Hf、Hb/Tab、Hf/Hb均有顯著降低(P＜0.01)；痰濁證患者與正常組比較，Hb、He、Hf及Hf/Hb均有顯著降低(P＜0.01)；血瘀證患者與痰濁證患者比較，Hb、Hb/Tab有顯著降低(P＜0.01)。見表3。表3 早發(fā)冠心病患者及健康人面部光電血流容積指標比較(略)注：與血瘀證比較，*P＜0.01；與正常組比較，#P＜0.01

3 討論

NO和ET是由血管內(nèi)皮細胞合成、釋放的一對血管舒縮因子。ET是已知的最有力的內(nèi)源性血管收縮因子，主要由血管內(nèi)皮產(chǎn)生的一種作用強烈且持久的血管收縮肽，過量釋放可引起冠狀動脈痙攣，促進心肌收縮，加重心肌缺血和心肌再灌注損傷[9-12]。NO是血管內(nèi)皮細胞分泌的作用極強的舒血管因子，是維持血管舒張的主要來源，具有舒張血管平滑肌的作用，并對抗內(nèi)皮源性收縮因子。NO為ET的生理拮抗劑， 持續(xù)基礎(chǔ)釋放對維持心血管系統(tǒng)恒定的舒張、調(diào)節(jié)冠狀動脈基本張力、保持心肌血流灌注有著重要作用[13]。正常情況下，機體中NO和ET都有少量分泌，以維持機體正常需要，二者含量相對穩(wěn)定，達到一種平衡狀態(tài)。但缺血后，由于血塊對血管的刺激、血管內(nèi)壓增高及炎癥反應，使內(nèi)皮素mRNA表達增加，內(nèi)皮素合成及釋放增加，引起動脈的強烈收縮，進而使局部腦組織缺血缺氧，導致腦缺血，尤其是側(cè)枝循環(huán)不良的組織；而由內(nèi)皮素引發(fā)的白細胞粘附血管壁以及其激活的炎性因子均可加強腦血管痙攣、組織缺血，并且損傷組織細胞及內(nèi)皮細胞，使得內(nèi)皮源性NO合成減少或者拮抗了其舒張作用；另一方面，紅細胞裂解釋放出的氧合血紅蛋白可使NO滅活，ET/NO之間的平衡被打破，從而破壞了正常的血管舒張功能。Sakowitz[12]認為，血管痙攣與可利用的NO減少以及繼發(fā)的血管收縮因子和血管舒張因子失衡有關(guān)。

在本研究中，將血瘀證組、痰濁證組和正常組進行比較時，我們發(fā)現(xiàn)光電血流容積主波幅在這3組中差異有統(tǒng)計學意義，其中在血瘀證組波幅最低，痰濁證組次之，而正常組最高[14]。這與中醫(yī)理論中有形之邪或有形的病理產(chǎn)物阻塞脈絡(luò)，氣血運行不暢而致痰阻血瘀，脈來不暢的理論相一致。同時，NO血瘀證組的含量明顯低于正常組，而痰濁證組與血瘀證組及正常組無差異，ET各組間無差異，考慮為光電血流容積主波幅能夠敏感、及時、直接地反映血流容積的變化，側(cè)重于血管功能的反應，而作為血管擴張的物質(zhì)基礎(chǔ)的NO和ET則反應沒有那么敏感。說明光電血流容積主波幅能夠及時反映血流的變化，敏感于生物活性物質(zhì)的釋放，能為臨床及科研提供及時的資料。

在按光電血流容積主波幅的高低對NO及ET進行觀察，我們發(fā)現(xiàn)，隨著光電血流容積主波幅的增加，NO值逐漸增加，與之呈正相關(guān)；而ET值逐漸下降，與光電血流容積主波幅呈負相關(guān)，并且在高波幅組和低波幅組差異有統(tǒng)計學意義。說明隨著NO/ET值逐漸增大，血管舒張功能加強而處于擴張狀態(tài)，血流容積增大，所以光電容積主波幅增高。可見，光電血流容積主波幅的變化與NO及ET的變化關(guān)聯(lián)性很好，可以準確反映血管的擴張狀態(tài)及血管擴張時體內(nèi)生物活性物質(zhì)的變化，為科研及臨床提供可靠的證據(jù)。

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