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篇1

英文名稱：Microbiology

主管單位：中國(guó)科學(xué)院

主辦單位：中國(guó)科學(xué)院微生物研究所;中國(guó)微生物學(xué)會(huì)

出版周期：月刊

出版地址：北京市

語(yǔ)

種：中文

開

本：16開

國(guó)際刊號(hào)：0253-2654

國(guó)內(nèi)刊號(hào)：11-1996/Q

郵發(fā)代號(hào)：2-817

發(fā)行范圍：國(guó)內(nèi)外統(tǒng)一發(fā)行

創(chuàng)刊時(shí)間：1974

期刊收錄：

CA 化學(xué)文摘(美)(2009)

中國(guó)科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫(kù)(CSCD―2008)

核心期刊：

中文核心期刊(2008)

中文核心期刊(2004)

中文核心期刊(2000)

中文核心期刊(1996)

中文核心期刊(1992)

期刊榮譽(yù)：

中科雙效期刊

聯(lián)系方式

期刊簡(jiǎn)介

篇2

論文摘要：社會(huì)醫(yī)療保險(xiǎn)經(jīng)辦機(jī)構(gòu)應(yīng)成為醫(yī)療服務(wù)市場(chǎng)上的具有強(qiáng)大談判能力的第三方購(gòu)買者，代表病人向醫(yī)療機(jī)構(gòu)購(gòu)買服務(wù)，確保醫(yī)療服務(wù)的質(zhì)量與價(jià)格相匹配。由于種種原因，我國(guó)大學(xué)生醫(yī)療保險(xiǎn)制度長(zhǎng)期以來(lái)一直未能落實(shí)好這項(xiàng)職能。目前，國(guó)家正在開展把大學(xué)生納入城鎮(zhèn)居民基本醫(yī)療保險(xiǎn)的試點(diǎn)范圍，我們應(yīng)該以此為契機(jī)，理順關(guān)系，創(chuàng)造條件，充分利用醫(yī)療服務(wù)合同為大學(xué)生提供高質(zhì)量的醫(yī)療服務(wù)。

醫(yī)療服務(wù)合同是指由醫(yī)療保險(xiǎn)機(jī)構(gòu)與醫(yī)療服務(wù)機(jī)構(gòu)簽訂的由醫(yī)療服務(wù)機(jī)構(gòu)為特定的疾病患者提供醫(yī)療服務(wù)，并由醫(yī)療保險(xiǎn)機(jī)構(gòu)支付醫(yī)療服務(wù)費(fèi)用的合同。世界各國(guó)為有效地控制醫(yī)療費(fèi)用，提高醫(yī)療服務(wù)質(zhì)量，均采用了醫(yī)療服務(wù)合同的形式來(lái)明確醫(yī)療保險(xiǎn)機(jī)構(gòu)與醫(yī)療服務(wù)機(jī)構(gòu)之間的權(quán)利義務(wù)。大學(xué)生納入城鎮(zhèn)居民基本醫(yī)療保險(xiǎn)后，應(yīng)充分利用醫(yī)療服務(wù)合同，明確醫(yī)患雙方的權(quán)利義務(wù)，為大學(xué)生提供價(jià)格合理、診治到位、服務(wù)高效的醫(yī)療服務(wù)。

一、大學(xué)生醫(yī)療服務(wù)合同的性質(zhì)界定

醫(yī)療保險(xiǎn)體系的首要功能是為參保者提供醫(yī)療保障，確保他們不會(huì)因?yàn)橹Ц独щy而不去看病。醫(yī)療保險(xiǎn)體系的另外一個(gè)重要功能，就是建立醫(yī)療服務(wù)的第三方購(gòu)買者。當(dāng)人們把醫(yī)療費(fèi)用付給醫(yī)療保險(xiǎn)機(jī)構(gòu)后，醫(yī)療保險(xiǎn)機(jī)構(gòu)就形成了強(qiáng)大的購(gòu)買力，成為醫(yī)療服務(wù)市場(chǎng)上的具有強(qiáng)大談判能力的購(gòu)買者，它代表病人向醫(yī)療機(jī)構(gòu)購(gòu)買服務(wù)，有能力運(yùn)用各種手段來(lái)控制醫(yī)療服務(wù)機(jī)構(gòu)的行為，確保醫(yī)療服務(wù)的質(zhì)量與價(jià)格相匹配。大學(xué)生醫(yī)療服務(wù)合同涉及參保方、醫(yī)療保險(xiǎn)經(jīng)辦機(jī)構(gòu)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)三方關(guān)系，具有如下性質(zhì)特征：

1.大學(xué)生醫(yī)療服務(wù)合同是的為他人利益訂立的合同。在這—合同中，大學(xué)生只享受權(quán)利而不必承擔(dān)義務(wù)，合同的訂立無(wú)須事先通知或征得他們的同意。但自合同成立時(shí)起，他們就是債權(quán)人，享有獨(dú)立的權(quán)利，在醫(yī)療服務(wù)機(jī)構(gòu)不履行合同時(shí)，可以直接針對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)行使所享受的權(quán)利。大學(xué)生可以接受醫(yī)療合同中為其設(shè)定的權(quán)利，也可以拒絕接受該權(quán)利，但不能變更合同規(guī)定的權(quán)利，合同的更改權(quán)由醫(yī)療保險(xiǎn)經(jīng)辦機(jī)構(gòu)行使。由于大學(xué)生無(wú)權(quán)參與合同的訂立和變更，為了確保合同訂立和變更能夠真正圍繞學(xué)生的利益而進(jìn)行，并能有效地監(jiān)督和保證全面實(shí)際地履行，必須有一個(gè)主體集中代表大學(xué)生的利益，向經(jīng)辦機(jī)構(gòu)反映訴求并實(shí)施監(jiān)督權(quán)，高等學(xué)校對(duì)此具有不可推卸的責(zé)任。

2.大學(xué)生醫(yī)療服務(wù)合同是行政性合同。首先，醫(yī)療服務(wù)合同的一方當(dāng)事人為醫(yī)療保險(xiǎn)機(jī)構(gòu)，它是行政性的機(jī)構(gòu)或具有行政性的事業(yè)機(jī)構(gòu)，而它在訂立合同時(shí)也是以執(zhí)行行政性事務(wù)的名義與醫(yī)療服務(wù)機(jī)構(gòu)簽訂合同。其次，醫(yī)療服務(wù)合同的內(nèi)容是為疾病患者提供特定的醫(yī)療服務(wù)，它具有社會(huì)公共利益的性質(zhì)。再次，在醫(yī)療服務(wù)合同的履行、變更或解除中，醫(yī)療保險(xiǎn)機(jī)構(gòu)享有行政優(yōu)益權(quán)，即醫(yī)療服務(wù)機(jī)構(gòu)享有單方面對(duì)合同履行監(jiān)督權(quán)，單方面強(qiáng)制履行權(quán)和單方面的合同解除權(quán)以及單方面的制裁權(quán)。最后，醫(yī)療服務(wù)合同爭(zhēng)議的處理只能依據(jù)行政程序進(jìn)行，即通過(guò)行政復(fù)議和行政訴訟解決當(dāng)事人之間的糾紛。

3.大學(xué)生醫(yī)療服務(wù)合同具有平等性和隸屬性。平等性體現(xiàn)在醫(yī)療保險(xiǎn)機(jī)構(gòu)與醫(yī)療服務(wù)機(jī)構(gòu)在簽訂合同時(shí)，醫(yī)療服務(wù)機(jī)構(gòu)既可以同意與醫(yī)療保險(xiǎn)機(jī)構(gòu)訂立合同，也可以不同意與醫(yī)療保險(xiǎn)機(jī)構(gòu)訂立合同，并可就訂約內(nèi)容相互之間進(jìn)行協(xié)商。但是合同一經(jīng)簽訂，合同當(dāng)事人之間的關(guān)系便具有管理和被管理性質(zhì)。醫(yī)療保險(xiǎn)機(jī)構(gòu)有權(quán)對(duì)醫(yī)療服務(wù)合同的執(zhí)行情況進(jìn)行監(jiān)督檢查，并行使制裁權(quán)。因此，大學(xué)生醫(yī)療保險(xiǎn)合同能否順利簽訂，簽訂之后能否完全實(shí)際履行，經(jīng)辦機(jī)構(gòu)起著至關(guān)重要的作用。

二、大學(xué)生醫(yī)療服務(wù)合同現(xiàn)狀及原因

我國(guó)大學(xué)生醫(yī)療保障制度一直未能很好地實(shí)現(xiàn)醫(yī)療服務(wù)第三方購(gòu)買者的職能，保險(xiǎn)經(jīng)辦機(jī)構(gòu)通過(guò)設(shè)定自付線、起付線、封頂線、可報(bào)銷藥品目錄等各種手段，對(duì)學(xué)生的就醫(yī)行為進(jìn)行嚴(yán)格的控制，但是對(duì)服務(wù)提供者的行為卻近乎不聞不問(wèn)。學(xué)生作為單個(gè)病人出現(xiàn)在醫(yī)療服務(wù)機(jī)構(gòu)面前，處于明顯的弱勢(shì)地位，沒有能力要求醫(yī)療服務(wù)機(jī)構(gòu)提供與其支付費(fèi)用相匹配的醫(yī)療服務(wù)。究其原因，有如下幾點(diǎn)：

1.傳統(tǒng)大學(xué)生醫(yī)療費(fèi)用報(bào)銷模式妨礙了醫(yī)療保險(xiǎn)經(jīng)辦方談判權(quán)的行使。改革開放后的大學(xué)生醫(yī)療保險(xiǎn)分為兩類，一是大學(xué)生公費(fèi)醫(yī)療，二是由各高校自行組織學(xué)生參加的商業(yè)保險(xiǎn)。不論是高校公費(fèi)醫(yī)療的經(jīng)辦，還是商業(yè)保險(xiǎn)公司費(fèi)用的報(bào)銷，都是要求學(xué)生在就醫(yī)時(shí)必須支付全額醫(yī)療費(fèi)用，然后再向?qū)W校和保險(xiǎn)公司尋求報(bào)銷。在這種模式下，學(xué)校和商業(yè)保險(xiǎn)公司處于被動(dòng)狀態(tài)，無(wú)法有效行使醫(yī)療服務(wù)購(gòu)買者的職能。

2.社會(huì)醫(yī)療保險(xiǎn)機(jī)構(gòu)由于角色定位不當(dāng)，未能行使購(gòu)買者的權(quán)利。在市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)環(huán)境下，經(jīng)辦機(jī)構(gòu)往往忽視了醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)在的盈利動(dòng)機(jī)，在醫(yī)療保險(xiǎn)的運(yùn)作過(guò)程中，僅把參保者作為防范對(duì)象，沒有對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行有效的監(jiān)管。這突出表現(xiàn)在經(jīng)辦機(jī)構(gòu)長(zhǎng)期以來(lái)只注重醫(yī)療保險(xiǎn)費(fèi)用需方控制而忽視供方控制這一現(xiàn)象上。因此，雖然目前社會(huì)醫(yī)療保險(xiǎn)費(fèi)用支付和補(bǔ)償已逐步由后付制向預(yù)付制過(guò)渡，經(jīng)辦機(jī)構(gòu)與醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)等談判的條件也開始形成，但如果經(jīng)辦機(jī)構(gòu)的觀念和角色定位不轉(zhuǎn)變，大學(xué)生納入城鎮(zhèn)居民基本醫(yī)療保險(xiǎn)后，其購(gòu)買者的權(quán)力仍然無(wú)法實(shí)現(xiàn)。

3.醫(yī)療服務(wù)市場(chǎng)發(fā)育不成熟，賣方市場(chǎng)沒有形成，經(jīng)辦機(jī)構(gòu)難以進(jìn)行公平對(duì)等的談判。由于我國(guó)醫(yī)療機(jī)構(gòu)的分布和設(shè)置不能滿足國(guó)民對(duì)醫(yī)療服務(wù)的需求，因此吸收民間資本以充實(shí)和發(fā)展醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)成為我國(guó)醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展的大趨勢(shì)。但由于醫(yī)療機(jī)構(gòu)準(zhǔn)入門檻過(guò)高，限制了民營(yíng)資本的進(jìn)入，目前在醫(yī)療服務(wù)市場(chǎng)發(fā)揮作用的，還是數(shù)量、條件都有限的公立醫(yī)院。由于市場(chǎng)發(fā)育不充分，沒有對(duì)公立醫(yī)院形成競(jìng)爭(zhēng)壓力，市場(chǎng)機(jī)制不能發(fā)揮作用。在這種情況下，公立醫(yī)院處于獨(dú)家壟斷的地位，經(jīng)辦機(jī)構(gòu)沒有選擇和談判的余地，難以進(jìn)行對(duì)等的談判。

三、充分發(fā)揮醫(yī)療服務(wù)合同的作用，為大學(xué)生提供公道合理的醫(yī)療服務(wù)

要在公正平等的基礎(chǔ)上訂立大學(xué)生醫(yī)療服務(wù)合同，必須理順醫(yī)療保險(xiǎn)機(jī)構(gòu)和醫(yī)院以及保險(xiǎn)機(jī)構(gòu)與學(xué)校的關(guān)系，在政府的參與下，推動(dòng)大學(xué)生醫(yī)療費(fèi)用的支付從公共報(bào)銷模式向公共契約模式的轉(zhuǎn)型。醫(yī)療保障機(jī)構(gòu)必須代表學(xué)生同醫(yī)療服務(wù)機(jī)構(gòu)訂立契約，在契約中采取各種支付手段(如費(fèi)用包干制、按人頭收費(fèi)、按病種收費(fèi)、按服務(wù)內(nèi)容收費(fèi)等)的組合，來(lái)引導(dǎo)醫(yī)療服務(wù)機(jī)構(gòu)在控制費(fèi)用和維持質(zhì)量上保持平衡，為學(xué)生爭(zhēng)取最大權(quán)益。

1.健全完善醫(yī)療費(fèi)用預(yù)付機(jī)制，為公共契約的訂立創(chuàng)造條件

預(yù)付制是訂立公共醫(yī)療服務(wù)契約的前提條件，醫(yī)療費(fèi)用由醫(yī)保經(jīng)辦機(jī)構(gòu)直接向醫(yī)療服務(wù)機(jī)構(gòu)提供，經(jīng)辦機(jī)構(gòu)便可以有效地行使其醫(yī)療服務(wù)購(gòu)買者的職能，迫使醫(yī)療服務(wù)機(jī)構(gòu)不斷提高醫(yī)療水平和保證服務(wù)質(zhì)量。隨著醫(yī)療保險(xiǎn)費(fèi)用支付和補(bǔ)償機(jī)制的不斷健全和完善，供方控制越來(lái)越受重視并日益加強(qiáng)對(duì)其監(jiān)控的力度，預(yù)付制正逐步取代傳統(tǒng)的后付制成為醫(yī)療保險(xiǎn)費(fèi)用的基本方式，訂立醫(yī)療服務(wù)合同的條件正在形成。目前這項(xiàng)工作的重點(diǎn)是要盡快理順醫(yī)保經(jīng)辦機(jī)構(gòu)與各級(jí)醫(yī)院(特別是初級(jí)醫(yī)院)的經(jīng)費(fèi)預(yù)付關(guān)系，為經(jīng)辦機(jī)構(gòu)全面履行醫(yī)療服務(wù)購(gòu)買職能創(chuàng)造條件。

2.加快醫(yī)療體制改革，發(fā)育完善醫(yī)療服務(wù)市場(chǎng)

市場(chǎng)機(jī)制作用的發(fā)揮，在于同行業(yè)之間形成競(jìng)爭(zhēng)，優(yōu)勝劣汰，迫使每一經(jīng)濟(jì)實(shí)體不斷改進(jìn)技術(shù)，提高服務(wù)質(zhì)量。從政策上來(lái)說(shuō)，占我國(guó)各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)絕大多數(shù)的公立醫(yī)院，既不是完全財(cái)政撥款的福利性單位，又不是以營(yíng)利為目的經(jīng)濟(jì)實(shí)體。這種政策上的盲區(qū)致使它既沒有能力為國(guó)民提供醫(yī)療衛(wèi)生福利，又沒有擔(dān)心生存發(fā)展的危機(jī)。由于患者和醫(yī)療保險(xiǎn)經(jīng)辦機(jī)構(gòu)別無(wú)他選，只能接受由他們單方制定的各種條件，毫無(wú)討價(jià)還價(jià)之力。加大醫(yī)療體制力度，放低醫(yī)療領(lǐng)域準(zhǔn)入門檻，鼓勵(lì)民間資本進(jìn)入醫(yī)療領(lǐng)域，實(shí)行充分競(jìng)爭(zhēng)，是克服上述問(wèn)題的最好良方。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)，讓醫(yī)療保險(xiǎn)經(jīng)辦機(jī)構(gòu)有更多的選擇余地，讓那些條件苛刻，經(jīng)營(yíng)無(wú)方，不能為患者提供等價(jià)優(yōu)質(zhì)服務(wù)的醫(yī)療單位失去訂單和市場(chǎng)，迫使他們改進(jìn)和提高服務(wù)水平。

3.落實(shí)各方責(zé)任，切實(shí)把學(xué)生的利益發(fā)在第一位

篇3

【摘要】 為了研究兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBM-MSC)的生物學(xué)特征及其對(duì)不同生長(zhǎng)因子的反應(yīng)，使用貼壁培養(yǎng)法從兔骨髓單個(gè)核細(xì)胞中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC），在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下觀察其基本生長(zhǎng)行為和生物學(xué)特征；使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)rBM-MSC的免疫學(xué)表型；RT-PCR法檢測(cè)其膠原表達(dá)；誘導(dǎo)rBM-MSC多向分化并使用特異性染色和RT-PCR予以鑒定；最后使用MTT法檢測(cè)IL-1、3、8和HGF對(duì)rBM-MSC生長(zhǎng)增殖的影響。結(jié)果顯示：貼壁生長(zhǎng)的rBM-MSC具有典型的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，可傳15代以上，第5代rBM-MSC高表達(dá)基質(zhì)受體CD44（32％），低表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD45（4.7％）；RT-PCR顯示高表達(dá)I型膠原，弱表達(dá)II型膠原，不表達(dá)X型膠原；在不同的誘導(dǎo)條件下，rBM-MSC 可被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞。rBM-MSC對(duì)IL-3最為敏感，10 ng/ml的低濃度IL-3可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖達(dá)32％以上（P

【關(guān)鍵詞】 骨髓； 間充質(zhì)干細(xì)胞；生長(zhǎng)因子；兔

Biological Characteristics of Rabbit Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and Their Response to Different Growth Factors

AbstractThis study was aimed to analyze the biological characteristics of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (rBM-MSCs) and their response to different growth factors. Rabbit BM-MSCs were separated from bone marrow mononuclear cells by using adherent cultivation. Biological characteristics were investigated by optical and electron microscopy. Immunophenotype of rBM-MSCs was measured by flow cytometry. The expression of collagen was detected by RT-PCR. Differentiation potential was identified by specific staining and RT-PCR. The response of rBM-MSCs to IL-1， 3， 8 and HGF with different concentrations were tested by MTT. The results showed that the rBM-MSCs gave rise to a population of adherent cells characterized by the presence of a predominant cell type with a typical fibroblast-like morphology and could be cultured for over 15 passages. CD44 was highly expressed on F5 rBM-MSCs (32%) and CD45 was lowly expressed (4.7%). Type I collagen was highly expressed， while type II collagen was lowly expressed and type X collagen was not detected on rBM-MSCs using RT-PCR method. In various conditions inducting differentiation， rBM-MSCs could differentiate into the osteoblast， chondrocyte， adipocyte and neuron-like cells. The rBM-MSCs were sensitive to IL-3， even low concentration (10 ng/ml) of IL-3 could promote the proliferation of rBM-MSCs effectively (>32％， P

Key wordsbone marrow; mesenchymal stem cell; growth factor; rabbit

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell， BM-MSC）具有高度自我更新和多向分化的潛能，在不同的誘導(dǎo)條件下，可分化為多種組織細(xì)胞類型，如骨髓基質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞［1］。目前對(duì)人和小鼠等物種的BM-MSC

已有深入研究，但對(duì)兔BM-MSC的生物學(xué)特性，尤其是其免疫學(xué)表型和對(duì)不同生長(zhǎng)因子的反應(yīng)鮮有報(bào)道。兔的形體較大，便于進(jìn)行移植和觀察，對(duì)兔BM-MSC的生物學(xué)特性進(jìn)行深入的研究對(duì)實(shí)驗(yàn)生物學(xué)具有重要意義。本研究采用貼壁培養(yǎng)法，在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增兔BM-MSC，對(duì)其形態(tài)特征、表面標(biāo)記、多向分化功能以及對(duì)不同細(xì)胞因子的反應(yīng)進(jìn)行初步研究，為以后的移植模型研究奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3月齡雄性新西蘭大白兔6只，體重1.8± 0.2公斤/只，購(gòu)自山東省農(nóng)科院兔場(chǎng)。

兔BM-MSC的分離培養(yǎng)

對(duì)兔按3％戊巴比妥鈉1 ml/kg體重行耳緣靜脈麻醉，無(wú)菌取股骨骨髓1 ml（肝素終濃度50 U/ml）。用淋巴細(xì)胞分離液（上海華精生物公司產(chǎn)品，相對(duì)密度1.077）獲得單個(gè)核細(xì)胞，以4×105/ml的密度懸浮于含10％小牛血清（杭州四季青產(chǎn)品）的高糖DMEM（Gibco/BRL公司產(chǎn)品）中，置100％濕度、5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)72小時(shí)后全量換液，棄非貼壁細(xì)胞，每3天全量換液，約2周后貼壁細(xì)胞鋪滿80％瓶底， 用0.25％胰蛋白酶（Gibco/BRL公司產(chǎn)品）常規(guī)消化傳代。

電子顯微鏡觀察和細(xì)胞組織化學(xué)染色

取第5代BM-MSC進(jìn)行掃描電子顯微鏡和透射電鏡觀察，并進(jìn)行常規(guī)堿性磷酸酶染色（ALP）和糖原染色（PAS）。

免疫表型檢測(cè)

取第5代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BM-MSC，消化后用含0.1％ BSA的PBS懸浮，調(diào)整密度為1×106/ml，分別標(biāo)記鼠抗兔CD44、鼠抗兔CD45和鼠抗MHC-I型分子抗體（IgG1，Serotec公司產(chǎn)品）10 μl，室溫放置30分鐘；另取1管作IgG同型對(duì)照；以緩沖液洗去未結(jié)合抗體，再加入200 μl FITC－羊抗鼠二抗（IgG，Beckman Coulter公司產(chǎn)品），避光孵育20分鐘，緩沖液洗去未結(jié)合抗體，流式細(xì)胞儀（CYTOMICSTMFC 500型，Beckman Coulter公司產(chǎn)品）檢測(cè)，結(jié)果用CYTOMETER 1.0軟件分析。

誘導(dǎo)分化及鑒定

成骨細(xì)胞取第5代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BM-MSC，約60％融合時(shí)加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含10％小牛血清，地塞米松0.1 μmol/L，維生素C 0.2 mmol/L，β-甘油磷酸鈉50 mmol/L，Sigma公司產(chǎn)品），每3天全量換液1次，2周后行堿性磷酸酶染色和茜素紅S染色。

軟骨細(xì)胞取培養(yǎng)第5代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BM-MSC，約60％融合時(shí)加入軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含10％小牛血清，TGF-β1 3 ng/ml（PeproTech EC公司產(chǎn)品），地塞米松 0.1 μmol/L，β-甘油磷酸鈉 5 mmol/L，維生素C 0.2 mmol/L，胰島素 2 μg/ml，丙酮酸鈉 30 μg/ml，牛血清白蛋白 0.4 mg/ml，亞硒酸 2 μg/ml，亞油酸 2 μg/ml，Sigma公司產(chǎn)品），誘導(dǎo)2周后甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)膠原表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)軟骨特異性Ⅱ型、Ⅹ型膠原和aggrecan基因表達(dá)。

脂肪細(xì)胞取第5代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BM-MSC，約90％融合時(shí)加入脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含10％小牛血清，胰島素6.25 μg/ml，地塞米松 0.1 μmol/L，IBMX 0.25 mmol/L，吲哚美辛 100 μmol/L（均為Sigma公司產(chǎn)品），2周后油紅O染色鑒定。

神經(jīng)細(xì)胞取第5代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BM-MSC，約90％融合時(shí)加入預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含10％小牛血清，bFGF 10 μg/L（PeproTech EC公司產(chǎn)品），48小時(shí)后加入神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含10％小牛血清，1％ DMSO，BHA 50 μmol/L，Sigma公司產(chǎn)品），3天后RT-PCR檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞特異性nestin和NF-M基因表達(dá)，免疫組織化學(xué)鑒定神經(jīng)特異性抗原NSE的表達(dá)，一抗為鼠抗兔NSE，二抗為生物素化羊抗鼠IgG（武漢博士德生物公司產(chǎn)品）。

基因表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)

細(xì)胞總RNA提取使用TRIzoL試劑 (Invitrogen公司產(chǎn)品)，反轉(zhuǎn)錄按照RT-PCR試劑盒（購(gòu)于北京博大泰克生物公司）說(shuō)明書操作。所得cDNA用于PCR擴(kuò)增，引物見附表（上海博亞生物公司合成）:擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 30秒，65℃ 45秒，72℃ 45秒，5個(gè)循環(huán)；95℃ 30秒，60℃ 45秒，72℃ 45秒，20個(gè)循環(huán)；95℃ 30秒，55℃ 45秒，72℃ 45秒，4個(gè)循環(huán)；最后72℃ 延伸10 分鐘，PCR產(chǎn)物使用 2% 瓊脂糖凝膠電泳分析。

不同細(xì)胞因子對(duì)兔BM-MSC增殖的影響

取第5代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BM-MSC，以2 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度培養(yǎng)于96孔板中，培養(yǎng)基為含10％小牛血清的高糖DMEM，分別加入不同濃度的IL-1、3、8和HGF（PeproTech EC公司產(chǎn)品），每組設(shè)12個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48小時(shí)后常規(guī)MTT法檢測(cè)MSC對(duì)不同生長(zhǎng)因子的增殖反應(yīng)，酶聯(lián)檢測(cè)儀(INTEC公司產(chǎn)品，Reader 2010型)檢測(cè)492 nm處吸光值。Table. Primer sequence（略）

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量數(shù)據(jù)用X+SD表示，組間差異分析用 t 檢驗(yàn)， P

結(jié)果

細(xì)胞形態(tài)及特異性染色

兔骨髓單個(gè)核細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)72小時(shí)后可見少量細(xì)胞貼壁，10天后BM-MSC能鋪滿80％瓶底，以成纖維樣細(xì)胞為主，HE染色可見核內(nèi)有2-4個(gè)明顯核仁（圖1A）；掃描電子顯微鏡下可見大部分細(xì)胞表面光滑（圖1B），少數(shù)梭形細(xì)胞有豐富的表面片狀皺褶；透射電子顯微鏡觀察顯示，膜光滑有少量微絨毛的成纖維樣細(xì)胞占大多數(shù)，該細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)比約為1∶5，細(xì)胞核中常染色質(zhì)豐富、分布均勻，圖1C可見雙核仁，核仁大而結(jié)構(gòu)清晰，核膜完整，可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、線粒體、溶酶體和一些髓鞘樣小體，胞質(zhì)中分別有大量核糖體和微絲。BM-MSC細(xì)胞膜微絨毛較多，靠近這些突起的細(xì)胞質(zhì)中分布有致密的微絲，形成一條高電子密度帶（圖1D）。細(xì)胞化學(xué)染色2%-3％的細(xì)胞堿性磷酸酶陽(yáng)性，在胞質(zhì)內(nèi)有紅棕色沉淀，陽(yáng)性細(xì)胞在形態(tài)上與陰性細(xì)胞沒有差異（圖1E）；糖原染色全部細(xì)胞均為陽(yáng)性，胞質(zhì)含大量紫紅色糖原顆粒（圖1F）。

誘導(dǎo)分化結(jié)果及其鑒定

加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液2-3天后，細(xì)胞開始從長(zhǎng)梭形縮短為多角形，細(xì)胞體積增大，誘導(dǎo)14天后茜素紅S染色為陽(yáng)性，堿性磷酸酶陽(yáng)性細(xì)胞大幅增加，表現(xiàn)出成骨細(xì)胞的特點(diǎn)（圖2A-C）；加入軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液后，細(xì)胞由長(zhǎng)梭形顯著縮短為橢圓形，體積增大，甲苯胺藍(lán)染色呈陽(yáng)性（圖2 D、E）。RT-PCR結(jié)果表明其表達(dá)軟骨細(xì)胞特異性的aggrecan基因，Ⅱ型膠原的基因表達(dá)也較誘導(dǎo)前增多，表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞分化的特點(diǎn)；但Ⅹ型膠原不表達(dá)（圖2 I: 1-4）；成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)后細(xì)胞胞漿內(nèi)開始出現(xiàn)細(xì)小脂滴，細(xì)胞排列無(wú)序，顯微鏡下可觀察到高折光性的脂滴。油紅O染色顯示脂肪細(xì)胞內(nèi)大量的大顆粒狀脂滴（圖2F）；神經(jīng)預(yù)誘導(dǎo)劑加入后細(xì)胞形態(tài)變得細(xì)長(zhǎng)，加入二次誘導(dǎo)劑后6小時(shí)內(nèi)約有60％的細(xì)胞死亡脫壁，剩余的細(xì)胞有50％表現(xiàn)為神經(jīng)元樣細(xì)胞特有的形態(tài)，伸出細(xì)長(zhǎng)的偽足（圖2G，H）。這些細(xì)胞表現(xiàn)為NSE免疫組化染色陽(yáng)性；RT-PCR結(jié)果顯示其表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性基因Nestin和NF-M（圖2 I: 5-6泳道）。

細(xì)胞表型及RT-PCR檢測(cè)

兔BM-MSC細(xì)胞上CD44抗原表達(dá)陽(yáng)性率為32％；CD45表達(dá)陽(yáng)性率為4.7％，MHC-Ⅰ型分子表達(dá)陽(yáng)性率為1.8％；流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果見圖3A-D。RT-PCR顯示第5代的兔BM-MSC高表達(dá)Ⅰ型膠原，弱表達(dá)Ⅱ型膠原，不表達(dá)X型膠原、aggrecan、nestin和NF-M基因（圖3E）。

不同細(xì)胞因子對(duì)兔BM-MSC增殖的影響

酶聯(lián)檢測(cè)和MTT結(jié)果顯示，兔BM-MSC對(duì)IL-1、3、8和HGF的反應(yīng)模式基本相同，均為低濃度促進(jìn)兔BM-MSC的增殖，高濃度反而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制效應(yīng)隨細(xì)胞因子濃度增加而增加；兔BM-MSC對(duì)IL-3的反應(yīng)最為明顯，10 ng/ml的IL-3可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖達(dá)32％以上（P

討論

目前分離MSC的方法多基于其黏附貼壁和體外快速增殖能力，鑒定MSC則主要是根據(jù)其形態(tài)和功能。目前普遍認(rèn)為BM-MSC表達(dá)CD13、CD29、CD44、CD59、CD105、CD166和HLA-ABC，不表達(dá)CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117和HLA-DR［2］。由于兔基因組計(jì)劃尚未完成，兔分化抗原的抗體難以得到，本實(shí)驗(yàn)僅能選擇CD44和CD45。細(xì)胞黏附分子CD44屬于基質(zhì)受體（matrix receptor），是分布極為廣泛的細(xì)胞表面單鏈穿膜糖蛋白，在淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞表面均能檢測(cè)到它的表達(dá)，專一性結(jié)合透明質(zhì)酸鹽并介導(dǎo)其內(nèi)吞，在細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞－基質(zhì)間作用中發(fā)揮重要作用［3］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，約1/3的兔BM-MSC表達(dá)CD44，與獼猴BM-MSC的數(shù)據(jù)相同［4］，但較人BM-MSC的數(shù)據(jù)（>94％）為低［5］，這證明了物種間存在差異。我們培養(yǎng)得到的兔BM-MSC高表達(dá)I型膠原，弱表達(dá)Ⅱ型膠原，不表達(dá)Ⅹ型膠原和aggrecan基因。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，目前已發(fā)現(xiàn) 19種膠原分子，I型膠原的分泌是MSC的標(biāo)志之一，可有效地促進(jìn)BM-MSC的黏附、增殖和分化［6］，有關(guān)報(bào)道證明，如將人BM-MSC向軟骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化，則aggrecan基因、Ⅱ型膠原和Ⅹ型膠原的表達(dá)就會(huì)顯著增加［7］，我們的試驗(yàn)結(jié)果顯示，將兔BM-MSC向軟骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化后，表達(dá)aggrecan基因和Ⅱ型膠原，而不表達(dá)Ⅹ型膠原，這與人BM-MSC數(shù)據(jù)有差異。兔BM-MSC除向軟骨細(xì)胞分化以外，我們還成功地使其誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞，證明了其具有多向分化潛能。骨髓中BM-MSC的含量?jī)H占1/106個(gè)有核細(xì)胞，并且隨著年齡的增加或體質(zhì)的衰弱，BM-MSC的數(shù)量逐漸減少［8］。因此要獲得足量的MSC，大量擴(kuò)增純化是十分必要的。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 第5代之前的兔BM-MSC具有旺盛的增殖速度，倍增時(shí)間約為40小時(shí)，細(xì)胞形態(tài)狹長(zhǎng)；從1 ml骨髓中獲得的BM-MSC傳代7-8次所得細(xì)胞數(shù)目可達(dá)5×108，已經(jīng)能夠足夠滿足體內(nèi)移植和一般實(shí)驗(yàn)研究所需。隨著重復(fù)傳代，細(xì)胞變得寬大，生長(zhǎng)速度下降，這和人BM-MSC中的研究結(jié)果相似，隨著BM-MSC的衰老，其對(duì)生長(zhǎng)因子的反應(yīng)能力和多向分化能力也會(huì)顯著下降［9］。BM-MSC除表達(dá)IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、 LIF、G-CSF、GM-CSF、M-SCF、FL 和SCF等多種細(xì)胞因子外，還能對(duì)bFGF、BMP、胰島素、TGF-β1和HGF等多種細(xì)胞因子作出增殖或分化響應(yīng)，證明其表達(dá)多種因子受體［11-13］。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了不同濃度的人IL-1、3、8和HGF對(duì)兔BM-MSC生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，低濃度的人IL-1、3、8和HGF能促進(jìn)兔BM-MSC的增殖，而高濃度則抑制其增殖，其中低濃度IL-3對(duì)兔BM-MSC的促增殖作用最為顯著，而高濃度的IL-3的抑制效果也較其他細(xì)胞因子明顯。BM-MSC本身不表達(dá)IL-1和IL-3［11，13］，IL-3主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生， 而IL-3受體主要表達(dá)于造血細(xì)胞上并介導(dǎo)造血細(xì)胞的增殖、分化或激活。有文獻(xiàn)表明，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞也表達(dá)IL-3受體，并可被TNF或IFN上調(diào)?；旌螴L-3 和IFN可上調(diào)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MHC II類分子并分泌IL-6和G-CSF等造血生長(zhǎng)因子［14］。根據(jù)我們的結(jié)果，IL-3受體也表達(dá)于BM-MSC，IL-3可能通過(guò)IL-3受體促進(jìn)BM-MSC的增殖并使其表達(dá)更多的造血生長(zhǎng)因子?？傊?，本研究成功地分離、培養(yǎng)了兔BM-MSC，檢測(cè)了其免疫表型和多向分化能力，與文獻(xiàn)報(bào)道的其他物種MSC的特性類似，并檢測(cè)了不同生長(zhǎng)因子對(duì)其生長(zhǎng)增殖的影響，為下一步應(yīng)用兔作為移植模型的研究奠定了基礎(chǔ)。

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篇4

資料與方法

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：于豬宰殺后30min內(nèi)清潔條件下取出心臟，經(jīng)過(guò)取瓣、修剪、滅菌培養(yǎng)等處理，制備20只主動(dòng)脈瓣膜，分別隨機(jī)分成5組，通過(guò)程序性降溫，采用液氮冷凍（-196℃）保存，將瓣膜完全浸潤(rùn)在凍存液中。分別經(jīng)過(guò)2周、4周、6周、8周、10周深低溫儲(chǔ)存后，解凍后測(cè)定不同儲(chǔ)存時(shí)限瓣膜生物力學(xué)指標(biāo)。

檢測(cè)指標(biāo)：生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)主要有組織厚度，組織含水量，熱皺縮溫度；強(qiáng)度、組織伸長(zhǎng)比。

統(tǒng)計(jì)分析：所有數(shù)據(jù)資料均以（χ±s）表示。采用SPSS 13.0、SAS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所有數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)后，兩樣本均數(shù)采用組間或配對(duì)t檢驗(yàn)，顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P

結(jié)果

深低溫保存不同時(shí)限5組瓣膜厚度、組織熱皺縮溫度及組織含水量隨著保存時(shí)限延長(zhǎng)呈逐漸遞增趨勢(shì)（f=8.238，p=0.074），但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；破壞強(qiáng)度及伸長(zhǎng)比各組間存在明顯差異，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)有顯著性差異，見表1。

討論

由于目前臨床運(yùn)用的人造心臟瓣膜

存在諸多的缺陷，機(jī)械瓣膜耐久性很好，但是術(shù)后抗凝的不當(dāng)會(huì)引起出血和血栓的發(fā)生，組織工程瓣膜能很好地解決這一問(wèn)題。最近研究表明其在細(xì)胞方面：不易黏附上去，膠原、彈力蛋白和蛋白聚糖等天然固有成分的缺失，力學(xué)性能較差。其主要原因?yàn)殪o態(tài)環(huán)境下培養(yǎng)的瓣膜上的內(nèi)皮細(xì)胞黏附力低下，同時(shí)人體心臟瓣膜的結(jié)締組織具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和分布形式，以耐受瓣葉起閉過(guò)程中不斷變化的應(yīng)力作用。以上研究提示生物瓣膜的細(xì)胞和纖維支架兩者都是造成瓣膜衰敗的重要因素。

同其他類型瓣膜相比同種瓣膜術(shù)后患者無(wú)須抗凝治療，廣泛應(yīng)用于瓣膜替換手術(shù)及嬰幼兒復(fù)雜先心病矯治術(shù)中。1962年Ross首次把人同種異體主動(dòng)脈瓣應(yīng)用于臨床并取得成功，1986年O'Bfien首創(chuàng)了液氮超低溫冷凍保存技術(shù)，提高瓣膜耐久性，有效地減少了由人工瓣膜引起的心內(nèi)膜炎的發(fā)生率。其機(jī)制主要在于深低溫環(huán)境可中斷細(xì)胞的代謝，將損傷減到最小。同時(shí)，有文獻(xiàn)報(bào)告冷凍保存技術(shù)能抑制移植物內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子的表達(dá)。因此目前如何提高同種瓣膜質(zhì)量與最適宜保存時(shí)限之間的關(guān)系受到學(xué)者們?cè)絹?lái)越多的重視。

活性同種瓣膜是指細(xì)胞或組織維持自身和與外界能進(jìn)行正常交換的能力。而正常心臟瓣膜細(xì)胞成分又由內(nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，內(nèi)皮細(xì)胞維持瓣膜表面的張力和通透性，抵抗血流沖擊導(dǎo)致的損傷等；而瓣膜間質(zhì)絀胞除了對(duì)瓣膜基質(zhì)的改建、重構(gòu)及對(duì)損傷的修復(fù)具有重要意義；細(xì)胞外基質(zhì)是生物力學(xué)性能的主要決定物質(zhì)，也提供了細(xì)胞黏附生長(zhǎng)的正常結(jié)構(gòu)和生理環(huán)境。

同時(shí)在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)瓣膜組織在程序降溫及深低溫保存后呈現(xiàn)一系列的變化，最早的改變是細(xì)胞固縮、水腫等現(xiàn)象。更嚴(yán)重的是細(xì)胞出現(xiàn)碎裂。整體看來(lái)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊。這樣變化解釋了該實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)檢測(cè)生物力學(xué)發(fā)現(xiàn)瓣膜組織在瓣膜厚度、組織熱皺縮溫度及組織含水量隨著保存時(shí)限延長(zhǎng)呈逐漸遞增趨勢(shì)。生物力學(xué)性能中主要決定物質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)在深低溫環(huán)境下受到不同程度的破壞，造成各實(shí)驗(yàn)組隨著時(shí)間推移破壞強(qiáng)度及伸長(zhǎng)比逐漸下降的結(jié)果，符合以前臨床和動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果。

篇5

【摘要】

目的 探討Th1和Th2細(xì)胞因子表達(dá)譜研究在V型瘡性腎炎(VLN)患者中的作用。方法 分離血清，通過(guò)抗體芯片技術(shù)同時(shí)檢測(cè)4種Th1和5種Th2細(xì)胞因子表達(dá)譜，并探討其與臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性。結(jié)果 ①細(xì)胞因子表達(dá)譜：在同時(shí)檢測(cè)的9種細(xì)胞因子中，VLN患者有4種表達(dá)上調(diào)，除了IL2屬于Th1細(xì)胞因子外，其他三種(IL4、IL10和IL13)均屬于Th2細(xì)胞因子，其中IL10較健康對(duì)照升高了10倍以上。②相關(guān)性研究：Pearson相關(guān)分析顯示IL10與SLIEDAI呈正相關(guān)、與血紅蛋白濃度呈負(fù)相關(guān)；此外，IL4和IL13均與尿蛋白濃度呈負(fù)相關(guān)，IL1與血肌苷之間呈正相關(guān)。結(jié)論 VLN患者體內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)異常以Th2細(xì)胞因子為主，提示抗Th2細(xì)胞因子可能在V型狼瘡患者中具有一定的治療作用。

【關(guān)鍵詞】 狼瘡性腎炎；細(xì)胞因子；免疫

ABSTRACT: Objective To study the effects of cytokines Th1 and Th2 in Class V lupus nephritis (VLN). Methods Serum concentration of Th1 cytokines (IFNγ， IL1， IL2 and TNFα) and Th2 cytokines (IL4， IL5， IL6， IL10 and IL13) were simultaneously analyzed using fast quant human Th1/Th2 protein array， and Pearson analysis was used to evaluate the association between cytokines and clinical parameters. Results ① Cytokine profiling: Among the 9 cytokines detected simultaneously by fast quant human Th1/Th2 protein array， the expression of four cytokines was upregulated obviously， namely， Th1 cytokines (IL2) and Th2 cytokines (IL4， IL10 and IL13); that of IL10 was 10 times above the normal control. ② Pearson correlation analysis: There was a positive correlation between IL10 and SLEDAI (r=0.877， P

KEY WORDS: lupus nephritis; cytokine; immunity

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus， SLE) 是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的、自身反應(yīng)性B細(xì)胞高度增生、大量高親和力的致病性的自身抗體產(chǎn)生的自身免疫性疾病[1]。狼瘡性腎炎(lupus nephritis， LN)是SLE患者較常見的最嚴(yán)重的并發(fā)癥和死亡的主要原因之一[2]。LN患者病程反復(fù)，伴有進(jìn)展性的組織病變，疾病的死亡率居高不下，目前主要是通過(guò)應(yīng)用非特異性免疫抑制劑和進(jìn)行抗炎治療。如果能了解SLE導(dǎo)致腎損傷的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新型的低毒性治療方法，會(huì)更好的進(jìn)行特異性的治療，改善狼瘡性腎炎患者的預(yù)后。

伴隨著免疫細(xì)胞的數(shù)量和功能上的異常，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的變化對(duì)LN病程的演進(jìn)有重要的作用：Th1型和Th2型細(xì)胞因子比例失調(diào)、細(xì)胞因子水平分泌增加或減少、細(xì)胞因子間相互的拮抗或協(xié)同作用增強(qiáng)或減弱等都參與了LN的發(fā)病過(guò)程[3]。但是，LN屬于一種以腎臟形態(tài)學(xué)異常為基礎(chǔ)的臨床綜合征，而且LN發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，同一個(gè)患者可以同時(shí)存在多種細(xì)胞因子的異常，不能孤立的看待某一種細(xì)胞因子的異常，而多種細(xì)胞因子間的相互作用可能更為重要。因此，本實(shí)驗(yàn)以V型LN患者為基礎(chǔ)，通過(guò)系統(tǒng)生物學(xué)的研究方法，借助高通量的抗體芯片技術(shù)同時(shí)觀察V型LN患者血清多種細(xì)胞因子(包括Th1細(xì)胞因子和Th2細(xì)胞因子)的變化，以期從免疫學(xué)網(wǎng)絡(luò)失衡角度闡明LN可能的發(fā)病機(jī)制，為治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

按照1982年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]選擇狼瘡性腎炎患者20例，均為女性，具有腎臟累及的臨床表現(xiàn)；均進(jìn)行腎活檢。根據(jù)1985年WHO改良病理分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型診斷符合彌漫膜性腎炎(V型)，根據(jù)SLEDAI評(píng)分(SLE Disease Activity Index)標(biāo)準(zhǔn)判斷LN患者腎活檢時(shí)疾病活動(dòng)情況[5]，所有患者3月內(nèi)未使用霉酚酸酯(MMF)或環(huán)磷酰胺(CTX)等強(qiáng)免疫抑制劑治療。同時(shí)選擇年齡和性別匹配的健康志愿者20例作為正常對(duì)照。

1.2 血清細(xì)胞因子檢測(cè)

清晨抽取空腹靜脈血5mL，離心后留取血清，-70℃保存待測(cè)。血清細(xì)胞因子的檢測(cè)采用德國(guó)Whatman公司提供的抗體芯片，同時(shí)定量檢測(cè)9種細(xì)胞因子的表達(dá)，其中包括4種Th1細(xì)胞因子IL1(白細(xì)胞介素1)、IL2(白細(xì)胞介素2)、IFNγ(γ干擾素)、TNFα(腫瘤壞死因子α)和5種Th2細(xì)胞因子IL4(白細(xì)胞介素4)、IL5(白細(xì)胞介素5)、IL6(白細(xì)胞介素6)、IL10(白細(xì)胞介素10)、IL13(白細(xì)胞介素13)的表達(dá)。每個(gè)因子檢測(cè)設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，取平均值。具體操作簡(jiǎn)述如下：玻片裝上孵育室并將玻片/孵育室一起裝入玻片夾；70μL封閉液室溫封閉15min；常溫孵育樣品過(guò)夜(輕微振蕩)；洗滌5次；生物素標(biāo)記的抗體室溫孵育60min(輕微振蕩)；洗滌5次；StreptavidinCy5室溫孵育45min(輕微振蕩)；洗滌5次；DiH2O沖洗玻片并干燥；掃描玻片，進(jìn)行資料分析。

1.3 其他實(shí)驗(yàn)室檢查

所有患者同時(shí)進(jìn)行以下檢查：①24h尿蛋白定量：采用雙縮脲比色法，正常值＜0.4g/24h；②自身抗體：抗核抗體(ANA)采用間接免疫熒光法，抗雙鏈DNA(dsDNA)采用短膜蟲法；③補(bǔ)體C3、C4：采用散射比濁法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異采用Students t檢驗(yàn)，并通過(guò)Pearson相關(guān)性分析研究細(xì)胞因子表達(dá)及淋巴細(xì)胞亞群與臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性。以P

2 結(jié) 果

2.1 患者的臨床實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)檢查

V型LN患者一般臨床資料見表1。V型LN患者白細(xì)胞、血紅蛋白、補(bǔ)體C3和C4均明顯低于健康對(duì)照組。與健康對(duì)照相比，白細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(5.015±1.426)×109/L和(6.271±2.730)×109/L(P

2.2 血清細(xì)胞因子的表達(dá)譜

V型LN患者所檢測(cè)的9種細(xì)胞因子中有4種較對(duì)照組升高，除IL2屬Th1細(xì)胞因子外(P

為明確細(xì)胞因子增長(zhǎng)情況，我們以健康對(duì)照組細(xì)胞因子平均值為基數(shù)，觀察了每種細(xì)胞因子增長(zhǎng)幅度，發(fā)現(xiàn)V型LN患者升高最明顯的細(xì)胞因子是IL10，較對(duì)照組升高了10倍以上，其他幾種細(xì)胞因子增高幅度均在3～5倍之間，提示在LN中存在明顯的細(xì)胞因子的比例失衡，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)之間的平衡被打破，表現(xiàn)為細(xì)胞因子上調(diào)幅度不均一。表2 V型狼瘡性腎炎和健康對(duì)照組Th1、Th2細(xì)胞因子濃度的變化（略）

2.3 相關(guān)性研究

Pearson相關(guān)分析顯示，主要是Th2細(xì)胞因子與臨床表現(xiàn)之間存在明顯的相關(guān)性，尤其是IL10，如IL10與SLIEDAI呈正相關(guān)(r=0.877，P

3 討 論

LN是我國(guó)最常見的繼發(fā)性腎小球腎炎，其臨床和腎臟病理改變存在顯著的不均一性和多樣性，不同的病理類型不僅反應(yīng)了形態(tài)學(xué)上的差異，更可能蘊(yùn)含不同的發(fā)病機(jī)制。V型病變表現(xiàn)為膜性病變，以上皮側(cè)免疫復(fù)合物沉積和補(bǔ)體沉積為主要特征，臨床上以大量蛋白尿?yàn)橥怀霰憩F(xiàn)，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。

如前所述，細(xì)胞因子參與免疫反應(yīng)的每一個(gè)環(huán)節(jié)。細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中，Th1/Th2細(xì)胞因子的失衡尤為受到研究者的關(guān)注，目前有Th2優(yōu)勢(shì)、Th1優(yōu)勢(shì)以及Th1向Th2轉(zhuǎn)化發(fā)展的優(yōu)勢(shì)等[6]不同的假說(shuō)。但是，Th1/Th2各代表了一組細(xì)胞因子，如果能同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)胞因子表達(dá)，將對(duì)研究細(xì)胞因子失衡在LN中的作用具有重要意義?？贵w芯片可以一次性的檢測(cè)上百上千種蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度，具有特異性強(qiáng)，敏感性高，檢測(cè)范圍廣等優(yōu)勢(shì)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用系統(tǒng)生物學(xué)的研究方法，通過(guò)高通量的抗體芯片技術(shù)對(duì)V型LN患者體內(nèi)9種細(xì)胞因子(包括Th1和Th2細(xì)胞因子)同時(shí)進(jìn)行分析，以便全面了解V型LN患者體內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。

本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)的9種細(xì)胞因子有4種明顯升高，包括一種Th1細(xì)胞因子和3種Th2細(xì)胞因子。但是，增長(zhǎng)幅度顯著不同，以Th2細(xì)胞因子增長(zhǎng)最明顯，其中IL10增加最顯著，較健康對(duì)照組升高10倍以上，提示VLN患者體內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)平衡被打破。作為Th2細(xì)胞因子的代表， IL10 在SLE 體液免疫激活和自身抗體產(chǎn)生中有不可忽視的促進(jìn)作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，IL10基因多態(tài)性不僅與LN 全身活動(dòng)性相關(guān)，還對(duì)腎臟的臨床活動(dòng)和免疫病理?yè)p害產(chǎn)生影響[7]。自身抗體的產(chǎn)生是SLE發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素，與其相應(yīng)的自身成分結(jié)合成循環(huán)免疫復(fù)合物在機(jī)體各處沉積，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，引發(fā)炎癥反應(yīng)，造成廣泛的組織損傷[89]。作為B細(xì)胞活化和增殖的促進(jìn)因子，IL10血清水平的升高恰好可以解釋LN患者免疫系統(tǒng)的功能失調(diào)。

目前，關(guān)于細(xì)胞因子與LN疾病的相關(guān)性研究主要集中于細(xì)胞因子與狼瘡疾病活動(dòng)性指數(shù)、自身抗體之間的相關(guān)性上。但是，在此方面卻存在較大爭(zhēng)議。例如，RAPLEY等報(bào)道IL6水平與SLE活動(dòng)性相關(guān)[10]，WAIS卻認(rèn)為IL6與SLE活動(dòng)性無(wú)相關(guān)性[11]；作為一種Th1細(xì)胞因子，IFNγ在SLE發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[12]，而在本研究中發(fā)現(xiàn)VLN型患者體內(nèi)IFNγ無(wú)明顯改變，考慮與患者入選標(biāo)準(zhǔn)不同、細(xì)胞因子檢測(cè)方法不同有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)主要是Th2細(xì)胞因子與臨床表現(xiàn)之間存在相關(guān)性。例如，IL10與SLEDAI呈正相關(guān)，與血紅蛋白濃度呈負(fù)相關(guān)；IL4和IL13均與尿蛋白濃度呈負(fù)相關(guān)，提示Th2細(xì)胞因子可能參與腎臟疾病進(jìn)展。但是，本研究主要選擇未經(jīng)過(guò)強(qiáng)免疫抑制劑治療的患者，如果能增加部分活動(dòng)性相對(duì)較弱的病例，或?qū)θ脒x患者進(jìn)行免疫抑制劑治療后做縱向?qū)Ρ确治?，可能?huì)提供更有意義的數(shù)據(jù)，可通過(guò)治療前后細(xì)胞因子的變化判斷LN治療的效果，即細(xì)胞因子可能成為判斷LN病情及治療效果的生物學(xué)標(biāo)記物。

狼瘡性腎炎是發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，不僅淋巴細(xì)胞參與其中[13]，復(fù)雜的細(xì)胞因子免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，及其受體間平衡紊亂也可能參與狼瘡性腎炎的發(fā)生、發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)V型狼瘡性腎炎患者體內(nèi)存在廣泛的淋巴細(xì)胞異常及細(xì)胞因子表達(dá)譜異常，提示顯著的免疫功能紊亂。這可能是目前免疫抑制劑治療狼瘡性腎炎的基礎(chǔ)。但是，本課題僅限于未經(jīng)強(qiáng)免疫抑制劑治療的患者，如果能增加部分治療后的隨訪觀察結(jié)果，可能會(huì)對(duì)狼瘡性腎炎的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制及免疫抑制劑的治療機(jī)制提供進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)。

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篇6

關(guān)鍵詞：微生物學(xué)習(xí)；細(xì)菌分類；方法

中圖分類號(hào)：G642 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1002-7661（2015）16-006-02

簡(jiǎn)單地說(shuō)，微生物就是我們?nèi)祟愑萌庋酆茈y將其觀測(cè)到的細(xì)微生物。細(xì)菌是微生物中的一類，屬于原核生物，按照形態(tài)可以分為球菌、桿菌以及螺旋菌。細(xì)菌雖然微小，但是其分布極為廣泛，在人體中，細(xì)菌的數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)人體細(xì)胞的總量，其重要性由此可見。

一、關(guān)于微生物學(xué)的學(xué)習(xí)

在生物專業(yè)學(xué)習(xí)中，微生物學(xué)是其重要分支之一，可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)（例如釀酒、酸奶制作等）、醫(yī)藥（例如醫(yī)學(xué)中細(xì)菌病毒檢測(cè)、藥品中各種菌素片等）、生物工程以及細(xì)胞工程等等。由于微生物是我們?nèi)庋劭床灰娀蛘呖床磺宓募?xì)微生物，所以如果沒有顯微鏡，認(rèn)識(shí)起微生物來(lái)就不夠直觀，這也導(dǎo)致了人類歷史中很長(zhǎng)一段時(shí)間雖然有很多利用微生物的事件被記載，但都沒有意識(shí)到微生物的存在。所以在學(xué)習(xí)微生物學(xué)的過(guò)程中，要注重學(xué)生自己親身觀察實(shí)踐，利用顯微鏡等儀器，將微生物直觀地展示在學(xué)生眼前。

當(dāng)然在現(xiàn)代社會(huì)，絕大部分學(xué)生對(duì)微生物已經(jīng)不陌生，但是在沒有學(xué)習(xí)微生物學(xué)之前真正對(duì)其了解并喜愛的可能不多，在微生物學(xué)習(xí)過(guò)程中，還要注重學(xué)生學(xué)習(xí)興趣的培養(yǎng)，在學(xué)習(xí)之初，要通過(guò)微生物與人類息息相關(guān)的實(shí)例以及多媒體教學(xué)的視覺沖擊吸引學(xué)生的注意力，然后通過(guò)提出與生活有關(guān)的問(wèn)題引發(fā)學(xué)生的思考，讓其對(duì)微生物學(xué)產(chǎn)生好奇，然后利用顯微境等儀器引導(dǎo)學(xué)生解答問(wèn)題，激起學(xué)生成就感，從而引發(fā)其興趣。

二、微生物學(xué)習(xí)中細(xì)菌分類概述

在微生物學(xué)習(xí)中，《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》以及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》是細(xì)菌分類以及細(xì)菌鑒定的權(quán)威以及代表作品，由于生物技術(shù)在不斷進(jìn)步，所以這兩部手冊(cè)也在不斷修訂。

目前，對(duì)細(xì)菌種類的研究主要是在細(xì)菌分類基礎(chǔ)上，對(duì)細(xì)菌菌株進(jìn)行鑒定；以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹研究細(xì)菌進(jìn)化關(guān)系；也有在同一屬的細(xì)菌范疇內(nèi)對(duì)細(xì)菌的種進(jìn)行分群聚類研究。這些研究都是以細(xì)菌分類為基礎(chǔ)，從中也可以看出在微生物學(xué)習(xí)中細(xì)菌分類的重要性。

在學(xué)習(xí)細(xì)菌分類的過(guò)程中，要注意細(xì)菌分類是不斷進(jìn)步不斷更新的，這主要是由于生物技術(shù)不斷推陳出新、研究細(xì)菌分類的方法就在不斷進(jìn)步。同時(shí)還要注意技術(shù)的更新?lián)Q代是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，新技術(shù)是在原有技術(shù)的基礎(chǔ)上不斷探索發(fā)明的，所以要注意不要因?yàn)橛辛诵录夹g(shù)，就將原有的完全拋棄，也許在研究過(guò)程中可以只使用新技術(shù)，但是在學(xué)習(xí)時(shí)，也應(yīng)該對(duì)歷史有所了解和認(rèn)識(shí)。所以學(xué)習(xí)細(xì)菌分類時(shí)，應(yīng)該全面、連貫。

三、微生物學(xué)習(xí)中細(xì)菌分類方法探討

對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類，方法非常重要。所以，在微生物學(xué)習(xí)中，細(xì)菌分類方法具有重要地位。目前，細(xì)菌分類的方法主要包括特征分類法、數(shù)值分類法、組分分類法、分子生物學(xué)分類法以及多相分類法等。

1、特征分類法

不同的細(xì)菌，其形態(tài)、代謝以及生存環(huán)境存在一定差異，在生物技術(shù)不發(fā)達(dá)的年代，人們依據(jù)形態(tài)、生理以及生存環(huán)境等基本特征對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類。不過(guò)由于細(xì)菌體積微小，使得這些特征的觀察較為籠統(tǒng)，所以這種分類方法比較粗獷，很難對(duì)細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步區(qū)分。特征分類法是一種古老、相對(duì)較為宏觀的分類方法。

2、數(shù)值分類法

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，數(shù)值分類法開始大規(guī)模興起。細(xì)菌的表性特征有很多，將這些特征全部進(jìn)行檢測(cè)，然后利用計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)這些特征進(jìn)行歸納分類，這就是數(shù)值分類法。相對(duì)特征分類法，數(shù)值分類法要精細(xì)一些，但是其需要測(cè)定的特征很多。由于數(shù)值分類法能夠定量反應(yīng)細(xì)菌特征，所以目前該方法應(yīng)用依然較為廣泛。

3、組分分類法

組分分類法主要利用質(zhì)譜、光譜、氣相色譜以及高效液相色譜等技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌的化學(xué)組分。需要檢測(cè)的細(xì)菌化學(xué)組分主要來(lái)源于細(xì)胞壁、細(xì)胞膜脂肪酸、枝菌酸、磷脂、醌、以及蛋白質(zhì)等。檢測(cè)細(xì)胞壁主要是檢測(cè)其氨基酸和糖分；脂肪酸和枝菌酸都是細(xì)胞膜的重要組成成分；磷脂是極性脂；醌是非極性脂，存在于線體膜以及細(xì)胞質(zhì)膜；蛋白質(zhì)組分檢測(cè)是采用全細(xì)胞蛋白質(zhì)凝膠電泳技術(shù)。

4、分子生物學(xué)分類法

分子生物學(xué)分類法主要包括16S rRNA基因等序列分析、GC含量分析、DNA指紋技術(shù)、ITS序列分析、DNA-RNA雜交技術(shù)以及DNA-DNA雜交技術(shù)。目前，該方法應(yīng)用廣泛，用于細(xì)菌分類、多樣性分析的基因除了16S rRNA基因外，還有16S～23SrRNA基因、tuf基因、hsp60基因、pheS基因等。當(dāng)然，16S rRNA基因在利用基因序列分析進(jìn)行細(xì)菌分類研究中應(yīng)用最為廣泛。

5、多相分類法

多相分類法就是綜合上述幾種方法進(jìn)行細(xì)菌分類，該方法是一種綜合的方法，將幾種單一方法結(jié)合起來(lái)，互相驗(yàn)證、補(bǔ)充，可以得到更為合理可信的結(jié)論。

四、結(jié)束語(yǔ)

微生物學(xué)習(xí)中，細(xì)菌分類是一項(xiàng)系統(tǒng)但又繁瑣的工作，而且細(xì)菌分布廣泛、變異快，新種不斷被發(fā)現(xiàn)，將新種進(jìn)行鑒定和分類應(yīng)該采用多種方法，而不能簡(jiǎn)單的通過(guò)單一方法就下結(jié)論，多相分類法就是用多種單一方法進(jìn)行分類鑒定，所以相對(duì)更為全面可靠。

參考文獻(xiàn)

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篇7

關(guān)鍵詞：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；聚γ-谷氨酸；硝酸鈉；補(bǔ)料發(fā)酵；生物量

中圖分類號(hào)：TQ920.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）04-0903-04

Optimizing Sodium Nitrate Fed-batch Culture on Poly（γ-glutamic acid） Fermentation by Bacillus licheniformis WX-02

XU Shang-hua，HU Li-fang，CHEN Shou-wen

（Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Huazhong Agricultural University ， Wuhan 430070，China）

Abstract： Bacillus licheniformis WX-02 was used to study the ways of improving poly（γ-glutamic acid）（γ-PGA） yield. The optimal conditions of sodium nitrate feeding for γ-PGA fermentation by Bacillus licheniformis WX-02 by flask-shaking fed-batch fermentation were the initial sodium nitrate concentration 10 g/L， and 5 g/L of sodium nitrate added when fermentation to 12 h. The fermentation was carried out in a 3 L fermentor， showing that the maximum of biomass and γ-PGA yield was 4.5 g/L and 38.7 g/L with increase of 55.2% and 14.8%， compared with the control. It is indicated that adding sodium nitrate can increase biomass， enhance the utilization of glutamate， and improve the γ-PGA fermentation.

Key words： Bacillus licheniformis； poly-gamma-glutamic acid； sodium nitrate； feeding fermentation； biomass

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 地衣芽孢桿菌WX-02，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選和保藏，保藏號(hào)為CCTCC M208065。

1.2 方法

參考文獻(xiàn)：

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篇8

英文名稱：Bulletin of Science and Technology

主管單位：浙江省科技技術(shù)協(xié)會(huì)

主辦單位：浙江省科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)

出版周期：雙月刊

出版地址：浙江省杭州市

語(yǔ)

種：中文

開

本：大16開

國(guó)際刊號(hào)：1001-7119

國(guó)內(nèi)刊號(hào)：33-1079/N

郵發(fā)代號(hào)：32-95

發(fā)行范圍：國(guó)內(nèi)外統(tǒng)一發(fā)行

創(chuàng)刊時(shí)間：1985

期刊收錄：

中國(guó)科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫(kù)(CSCD―2008)

核心期刊：

中文核心期刊(2008)

中文核心期刊(2000)

期刊榮譽(yù)：

Caj-cd規(guī)范獲獎(jiǎng)期刊

聯(lián)系方式

期刊簡(jiǎn)介

篇9

關(guān)鍵詞：PCR；農(nóng)業(yè)技術(shù)；發(fā)展簡(jiǎn)史；基本原理

中圖分類號(hào)： Q555 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

在生物學(xué)領(lǐng)域中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)作為體外擴(kuò)增基因序列的生物技術(shù)占有很重要的位置，并且與分子克隆技術(shù)和DNA序列分析方法構(gòu)成了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作和學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)。PCR技術(shù)的發(fā)明成為了生物界的里程碑并且是分子生物學(xué)的一項(xiàng)偉大的革命，它隨之帶來(lái)的是分子生物學(xué)以及生物技術(shù)在工業(yè)和產(chǎn)業(yè)的推進(jìn)和發(fā)展[1]。

1 PCR技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史

1971年Khorana最早提出了一個(gè)大膽的設(shè)想，那就是核酸體外擴(kuò)增。但是，當(dāng)時(shí)對(duì)于基因的排序和測(cè)序分析方法并不成熟，還沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)熱定性的DNA聚合酶，所以這個(gè)想法沒有任何實(shí)際意義的[2]。1985年美國(guó)的Kary Mullis受到高速公路的啟發(fā)，在科學(xué)Science雜志上發(fā)表了PCR技術(shù)學(xué)術(shù)論文。20世紀(jì)80年代初，美國(guó)科學(xué)家Keohanog通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室中所使用的酶的改進(jìn)，大大提高了擴(kuò)增的可實(shí)行性[3-5]。在之后的幾十年里，PCR技術(shù)已經(jīng)發(fā)展為十幾種研究領(lǐng)域。

2常用的PCR技術(shù)

2.1 原位PCR

原位PCR是在組織切片或組織細(xì)胞里進(jìn)行的PCR反應(yīng)，它具有高度特異敏感和細(xì)胞定位能力，可以在細(xì)胞和分子水平上檢測(cè)轉(zhuǎn)特定的基因序列 [2]。

2.2 不對(duì)稱PCR

不對(duì)稱PCR是在PCR反應(yīng)過(guò)程中采用兩種不同濃度的寡核苷酸引物，經(jīng)過(guò)若干輪采用循環(huán)后，待低濃度的引物被消耗盡，隨后的循環(huán)只產(chǎn)生高濃度的產(chǎn)物既延伸產(chǎn)物，結(jié)果產(chǎn)生了大量的特異單鏈DNA[2]。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄—PCR

逆轉(zhuǎn)錄PCR是以反轉(zhuǎn)錄DNA即cDNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，能夠使mRNA呈現(xiàn)多態(tài)性并且利用基因表達(dá)測(cè)定的強(qiáng)度和鑒定已被轉(zhuǎn)錄的序列是否發(fā)生突變，主要克隆mRNA的3’和5’的末端序列，以及可以從非常少量的信使RNA樣品中構(gòu)建cDNA文庫(kù)[5]?？梢允狗治鲆恍O為微量的RNA樣品變?yōu)榭赡躘6-8]。

2.4 反向PCR

PCR只能擴(kuò)增兩端序列已知的基因片段，PCR可擴(kuò)增中間一段已知序列，而兩端序列未知的基因片段不擴(kuò)增。反向PCR的目的在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說(shuō)這一反應(yīng)體系不是在一對(duì)引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。

2.5 多重PCR

多重PCR在同一個(gè)PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入了兩對(duì)或兩對(duì)以上的寡核苷酸引物，并且同時(shí)能擴(kuò)增出數(shù)量較多的核酸片段的PCR，其反應(yīng)原理和操作過(guò)程一般與其他PCR相同[4-7]。

2.6巢式PCR

巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），使用兩對(duì)PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第1對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第2對(duì)引物稱為巢式引物結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第2次PCR擴(kuò)增片段短于第1次擴(kuò)增 。

2.7錨定PCR

用于擴(kuò)增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分別用多聚dC和已知的序列作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8]。

2.8重組PCR

重組PCR就是使兩個(gè)不相鄰的基因片段重組在一起的PCR。但是重組PCR所重組的基因片段長(zhǎng)度都在1kb左右，因此在長(zhǎng)片段的重組技術(shù)和提高準(zhǔn)確度來(lái)說(shuō)目前還有比較大的難度。

2.9定量PCR技術(shù)

PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過(guò)程的監(jiān)測(cè)，進(jìn)行PCR起始模板量的定量。目前，主要采用定量的PCR方法主要包括設(shè)立內(nèi)參照物的定量PCR、極限稀釋法、熒光定量PCR、FQ-PCR、定時(shí)定量PCR等。

2.10 熱不對(duì)稱性PCR

熱不對(duì)稱性PCR是以基因組的DNA作為模板，并且利用依照目標(biāo)的序列已知序列設(shè)計(jì)出3個(gè)具有較高退火溫度的嵌套特異性引物，和一個(gè)長(zhǎng)度較為短Tm值的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行組合，通過(guò)3輪具有熱不對(duì)稱的溫度循環(huán)進(jìn)行分級(jí)和擴(kuò)增PCR，并且在獲得已知序列的側(cè)翼序列后用3個(gè)嵌套特異性引物分別與簡(jiǎn)并引物組合來(lái)進(jìn)行PCR反應(yīng)。

3 結(jié)論

PCR技術(shù)是一種極為重要的分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)，還可以成為基因工程來(lái)提供目的基因，并且廣泛地應(yīng)用在親自鑒定、個(gè)體識(shí)別、免疫配型、疾病診斷等方面。可以說(shuō)，PCR技術(shù)已經(jīng)滲透到生物科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。

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篇10

關(guān)鍵詞：生物；教學(xué)技巧；語(yǔ)言點(diǎn)撥

中圖分類號(hào)：G632 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1002-7661（2012）21-144-01

點(diǎn)撥教學(xué)法是教學(xué)中的一種重要的教學(xué)技巧，隨著時(shí)代的進(jìn)步，點(diǎn)撥法有了新的發(fā)展中的內(nèi)容和要求，語(yǔ)言點(diǎn)撥作為一種傳統(tǒng)的教學(xué)技巧，在新的教學(xué)要求下也要與時(shí)俱進(jìn)：在現(xiàn)代教育科學(xué)思想理論的指導(dǎo)下，貫徹啟發(fā)式教學(xué)原則，靈活綜合運(yùn)用各種具體教學(xué)方法的一種現(xiàn)代化和科學(xué)化的教學(xué)，是貫徹素質(zhì)教育、提高學(xué)生能力的有效方法。

生物課程是一門基礎(chǔ)性的實(shí)驗(yàn)性的學(xué)科，對(duì)培養(yǎng)學(xué)生的能力有著天然的優(yōu)勢(shì)，在生物課程中，點(diǎn)撥是一種重要的教學(xué)技巧，對(duì)培養(yǎng)學(xué)生的綜合能力有著不可取代的作用。

語(yǔ)言點(diǎn)撥是指在學(xué)生學(xué)習(xí)的過(guò)程中，思維或語(yǔ)言產(chǎn)生障礙時(shí)，教師借助精練恰當(dāng)?shù)恼Z(yǔ)言進(jìn)行點(diǎn)撥，幫助學(xué)生突破障礙，使思維進(jìn)程加快，語(yǔ)言表達(dá)流暢。有以下幾種點(diǎn)撥方法：

一、輔助點(diǎn)撥 當(dāng)學(xué)生的思維活動(dòng)因智力水平或努力程度不夠等原因，在解決難度較大的問(wèn)題顯得力不從心時(shí)，就需要教師助一臂之力。例如，當(dāng)講完“爬行類”時(shí)，教師若直接讓學(xué)生回答“為什么青蛙和鱉都能生活在水中，又能生活在潮濕的陸地，但它們卻不屬同類生物”這一問(wèn)題時(shí)，不少學(xué)生有一定困難。這時(shí)教師可設(shè)計(jì)幾個(gè)帶有啟發(fā)性的階梯問(wèn)題進(jìn)行點(diǎn)撥：二者的呼吸方式有何不同？二者的皮膚有何不同？二者的生殖和發(fā)育有何不同？這樣學(xué)生便可由表及里地抓住事物本質(zhì)，解決學(xué)習(xí)中的疑點(diǎn)、難點(diǎn)，形成良好的認(rèn)知結(jié)構(gòu)。

二、旁敲側(cè)擊 它是指教師不直接點(diǎn)明思路，而是間接的、暗示的、曲折的進(jìn)行點(diǎn)撥，或言在此意在彼的啟發(fā)；或旁敲側(cè)擊的暗示；或迂回曲折的誘導(dǎo)；或在問(wèn)題的峰回路轉(zhuǎn)處巧設(shè)標(biāo)志，使其洞天疊出、曲徑通幽；或讓學(xué)生從舊知孕育出新知的生長(zhǎng)點(diǎn)；或讓學(xué)生在解決問(wèn)題時(shí)找到與之有聯(lián)系的相似點(diǎn)、相關(guān)點(diǎn)，受到啟發(fā)，展開聯(lián)想，產(chǎn)生靈感，找到解決問(wèn)題的最佳途徑。例如講“血液循環(huán)”時(shí)，讓學(xué)生回答“左心房連接的血管是動(dòng)脈血管還是靜脈血管？其中流動(dòng)的是動(dòng)脈血，還是靜脈血”這一問(wèn)題，當(dāng)學(xué)生答不上來(lái)時(shí)，教師可采用從旁點(diǎn)撥的方式進(jìn)行啟發(fā)：“和左心房相連的血管的血液流向何處？它的另一端連接的是什么器官？這個(gè)器官的作用是什么？”這樣學(xué)生便會(huì)茅塞頓開，不僅知其然，而且知其所以然，加深了對(duì)問(wèn)題的理解。

三、一語(yǔ)破的 教師在教學(xué)中采用直截了當(dāng)、開門見山、一語(yǔ)破的的點(diǎn)撥方法。例如學(xué)生有時(shí)解答問(wèn)題，盡管心中清楚，但由于對(duì)個(gè)別詞語(yǔ)的遺忘，或表述水平有限，一時(shí)難以找到恰當(dāng)?shù)脑~語(yǔ)來(lái)表述，導(dǎo)致“水壺裝餃子倒不出來(lái)”的情景，這時(shí)教師可直接給學(xué)生提供詞語(yǔ)，幫助其越過(guò)語(yǔ)言障礙，得到答案。

四、軸輻點(diǎn)撥 任何一個(gè)學(xué)生難于理解的知識(shí)點(diǎn)都有其關(guān)鍵點(diǎn)，這個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)與相關(guān)的知識(shí)點(diǎn)就像古代車輪的軸與輻的關(guān)系，教師以某一教學(xué)內(nèi)容為中心進(jìn)而引發(fā)出與之相關(guān)或相同的教學(xué)內(nèi)容就是軸輻點(diǎn)撥。如在引導(dǎo)學(xué)生閱讀“遺傳工程”這段短文時(shí)，可抓住克隆技術(shù)這個(gè)概念，由點(diǎn)到面地進(jìn)行點(diǎn)撥：克隆技術(shù)可消除遺傳疾??；可制造人的各種器官；可使滅絕的生物復(fù)活；動(dòng)植物可實(shí)施車間化生產(chǎn)等等。使學(xué)生具有擴(kuò)散性、廣闊性、靈活性。

五、向心聚點(diǎn) 它是與軸輻點(diǎn)撥相反的一種點(diǎn)撥方法，是教師為集中解決某一問(wèn)題由點(diǎn)到面、由此及彼進(jìn)行點(diǎn)撥。例如講“生物進(jìn)化的規(guī)律”時(shí)，教師可點(diǎn)出魚類、兩棲類、爬行類、哺乳類的生活習(xí)性、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理特征的異同，學(xué)生會(huì)不難發(fā)現(xiàn)生物的進(jìn)化規(guī)律是：由水生到陸生，由簡(jiǎn)單到復(fù)雜，由低等到高等，從而總結(jié)出規(guī)律性的東西，加深對(duì)問(wèn)題的理解，使其思維具有深刻性。

上面所談，只是教學(xué)實(shí)踐中的幾個(gè)舉例，而不是語(yǔ)言點(diǎn)撥內(nèi)容與方式的齊全羅列。我只能說(shuō)，像這些做法就是點(diǎn)撥，而不能說(shuō)，點(diǎn)撥法僅限于此。一言以蔽之，生物教學(xué)過(guò)程中的語(yǔ)言點(diǎn)撥法，應(yīng)根據(jù)具體內(nèi)容選擇適當(dāng)?shù)狞c(diǎn)撥方法，“當(dāng)點(diǎn)則點(diǎn)，當(dāng)撥則撥”，做到瀟灑自如，游刃有余，從而顯示出高超的點(diǎn)撥藝術(shù)的魅力。只有這樣，才能真正地發(fā)揮好教師的主導(dǎo)作用和學(xué)生的主體作用。

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