導(dǎo)語(yǔ)：如何才能寫(xiě)好一篇報(bào)的組詞，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

外人見(jiàn)到祖父祖母，總以為他們的愛(ài)情很美滿。確實(shí)做了五十年的夫妻，并不是一件容易的事，于是想當(dāng)然地認(rèn)為他們之間一定很和睦。但事實(shí)卻大相徑庭：其實(shí)，祖父與祖母間的吵嘴是每天都少不了的。祖父比較隨和，祖母則有些嚴(yán)肅，兩人總會(huì)為一個(gè)雞毛蒜皮的小事吵起來(lái)，吵不了幾句就停下，然后又為新的事斗嘴，如此循環(huán)，永不間斷。不過(guò)，吵架歸吵架，祖父祖母同樣深深關(guān)懷著對(duì)方。祖父時(shí)不時(shí)要到老年大學(xué)去聽(tīng)講座，若天色晚了還未回家，祖母便會(huì)搬把小凳子到下街去等，而祖父回來(lái)后也只是笑著說(shuō)她傻。

一次偶然的機(jī)會(huì)，我在祖父家的電腦上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)名為《金婚》的文件夾。好奇心驅(qū)使我打開(kāi)，才發(fā)現(xiàn)是祖父與祖母為紀(jì)念結(jié)婚五十周年而特地拍的婚紗照，其中有一張還模仿《泰坦尼克號(hào)》中的場(chǎng)景，兩人相擁在一起，臉上都洋溢著幸福的笑容，頗具美感。我不禁放聲大笑，笑聲招來(lái)了祖母。當(dāng)?shù)弥野l(fā)現(xiàn)他們的“秘密”時(shí)，祖母笑著把我叫到一邊，跟我說(shuō)：“想知道幕后的故事嗎？”我使勁點(diǎn)頭。她看了看窗外，便開(kāi)始講起了他們拍照的故事來(lái)。

原來(lái)，這照片不是兩人主動(dòng)去拍的，而是社區(qū)里組織的。開(kāi)始他們倆還死活不愿意去呢，說(shuō)是這么大的人了還去拍什么婚紗照。后來(lái)好說(shuō)歹說(shuō)是同意了，但是拍照時(shí)也很不順利，這對(duì)老夫妻連手都沒(méi)有怎么牽過(guò)，“可惡”的攝影師居然要求他們擁抱在一起?！胺凑沂撬阑畈煌?，你祖父倒無(wú)所謂?！弊婺刚f(shuō)這話時(shí)，無(wú)不帶有一絲自豪的情感，我偷笑。最后，兩人在拍攝組的勸說(shuō)下，終于同意“抱一下”。于是就有了這張照片?！翱烧娌缓?jiǎn)單哪！”我感嘆道?！翱刹皇锹?，唉，你祖父怎么還不回來(lái)”，祖母起身，眼睛盯著窗外。

第二天，我?guī)妥娓缚吹?，祖父在一旁下棋。街坊正好談到拍照一事，我便豎起了耳朵。

篇2

您好！自從XX年年9月被學(xué)校任命為年級(jí)組長(zhǎng)以來(lái)，我無(wú)時(shí)無(wú)刻不被學(xué)校的信任所感動(dòng)。兩個(gè)月來(lái)。我邊認(rèn)真工作邊思索我到底有沒(méi)有能力干好這一談工作，兩個(gè)月來(lái)我認(rèn)真小心的面對(duì)每位同事，每一位領(lǐng)導(dǎo)，面對(duì)每一件工作。但是我今天我選擇辭職，有很多原因：

1、作為年級(jí)組長(zhǎng)之后我深感自己太年輕，閱歷和經(jīng)歷較淺，不能全面細(xì)致考慮問(wèn)題。

2、自己的交際能力有限，自己很難處理與直管領(lǐng)導(dǎo)和同事們的關(guān)系，在一定程度上影響了各項(xiàng)工作的順利開(kāi)展。

3、妻子懷孕，家人較遠(yuǎn)，繁重的工作不能更好的照顧家庭。

4、自己壓力過(guò)大，好長(zhǎng)時(shí)間寢食難安，日漸消瘦，心情憂郁。

篇3

【關(guān)鍵詞】 腦出血;重組人粒細(xì)胞集落刺激因子;骨髓干細(xì)胞;大鼠

干細(xì)胞移植治療腦血管病及變性疾病已取得一定成效。但臨床上因移植操作存在有創(chuàng)性，同時(shí)干細(xì)胞來(lái)源困難，體外培養(yǎng)、分離純化技術(shù)尚未成熟及存在移植排斥等難題，使干細(xì)胞移植治療腦血管病在短期內(nèi)難以推廣應(yīng)用。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhGCSF)動(dòng)員的骨髓干細(xì)胞(BMSC)既有干細(xì)胞的部分優(yōu)點(diǎn)，又能克服干細(xì)胞移植的技術(shù)難題，理論上成為治療腦血管病的理想方法之一。rhGCSF對(duì)腦出血(ICH)是否具有神經(jīng)保護(hù)作用目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)研究，本實(shí)驗(yàn)擬用rhGCSF治療腦出血大鼠，探討rhGCSF是否對(duì)腦出血有神經(jīng)保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠72只，鼠齡3～4個(gè)月，雌雄不拘，體重250～300 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物與試劑 重組人粒細(xì)胞刺激因子注射液(rhGCSF，商品名金磊賽強(qiáng))，購(gòu)自長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司;溴脫氧尿苷(Brdu)、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3抗體(兔抗caspase3)和溴脫氧尿苷單克隆抗體(兔抗Brdu)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;SP試劑盒、加強(qiáng)型DAB顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及處理 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、治療組、ICH組。ICH組和治療組均用斷尾取自體血方法制備ICH模型，假手術(shù)組僅經(jīng)注射點(diǎn)注入生理鹽水。ICH后治療組在術(shù)后1 h開(kāi)始每天腹部皮下注射GCSF(50 μg·g-1·d-1)，另兩組腹部皮下注射等量生理鹽水。各組分別在術(shù)后1、3、7、14 d時(shí)間點(diǎn)行神經(jīng)功能缺損(NSS)評(píng)分后處死動(dòng)物。取腦。各組各時(shí)間點(diǎn)各取6只動(dòng)物。各組大鼠在處死前1 d，腹腔注射Brdu(50 mg/kg)3次，間隔2 h，以標(biāo)記分裂的骨髓干細(xì)胞。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 各組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)行10%水合氯醛麻醉后(2 ml/kg)，行心臟灌注及固定，腦組織石蠟包埋切片，分別行Brdu、caspase3抗體免疫組化染色，檢測(cè)免疫陽(yáng)性細(xì)胞，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。對(duì)Brdu、caspase3免疫陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，出血灶周邊區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行兩樣本均數(shù)間的t檢驗(yàn)，結(jié)果用x±s表示。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果 ICH組和治療組均產(chǎn)生不同程度的神經(jīng)功能缺損，假手術(shù)組無(wú)神經(jīng)功能缺損。術(shù)后1 d時(shí)ICH組與治療組評(píng)分沒(méi)有顯著差別(P>0.05)，3、7、14 d時(shí)治療組評(píng)分明顯低于ICH組(P

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.2.1 Brdu免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 ICH后在出血灶周邊可見(jiàn)Brdu陽(yáng)性細(xì)胞，但Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)隨出血時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少。在同一時(shí)間點(diǎn)，治療組的Brdu陽(yáng)性細(xì)胞均多于ICH組，但只有第1周的差別有顯著性(P

2.2.2 caspase3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 ICH后，各時(shí)間點(diǎn)治療組及ICH組表達(dá)均增高，但I(xiàn)CH組均較治療組增高明顯。見(jiàn)表3。表3 rhGCSF對(duì)ICH后caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響

3 討 論

以往認(rèn)為成熟神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞是終極細(xì)胞，受損后不能再生，而目前越來(lái)越多的證據(jù)表明腦有自身修復(fù)功能，成年腦的腦室下區(qū)、海馬齒狀回、室管膜區(qū)等區(qū)域存在自我更新和多種分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞〔1〕。腦出血可誘導(dǎo)內(nèi)源性干細(xì)胞的增殖、分化，但因數(shù)量少，因此誘導(dǎo)的自身修復(fù)能力有限。神經(jīng)干細(xì)胞移殖雖然為腦損傷的治療帶來(lái)生機(jī)，但倫理、來(lái)源、移殖損傷和排斥反應(yīng)等因素限制了其臨床應(yīng)用。

BMSC動(dòng)員是新興的細(xì)胞移殖方法，利用細(xì)胞因子使主要位于骨髓中的干細(xì)胞進(jìn)入外周血，通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)損傷組織以達(dá)到細(xì)胞移殖的目的。GCSF是BMSC強(qiáng)有力的動(dòng)員劑，可以提高外周血干細(xì)胞數(shù)量，且可向腦損傷部位遷移，在腦損傷的特定病理環(huán)境中向神經(jīng)細(xì)胞分化，以修復(fù)受損腦組織，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。

Mezey等〔2〕研究認(rèn)為，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠遷移到受損的腦組織區(qū)域并分化成不同的腦組織，包括神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞。Shuy等〔3〕用大鼠模型證實(shí)rhGCSF能動(dòng)員骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢至腦缺血損傷區(qū)，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)和功能康復(fù)，缺血大鼠用rhGCSF后MRI檢查可見(jiàn)病灶明顯縮小，并用免疫雙標(biāo)記染色證實(shí)rhGCSF能動(dòng)員骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在腦內(nèi)分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。這些研究為中樞神經(jīng)系統(tǒng)移植BMSC，促進(jìn)神經(jīng)再生，改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的生物學(xué)行為成為可能。

rhGCSF是BMSC強(qiáng)有力的動(dòng)員劑，它動(dòng)員的BMSC包括造血干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞〔4〕。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能產(chǎn)生堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等，使分化的祖細(xì)胞向著生成神經(jīng)細(xì)胞的方向分化。造血干細(xì)胞具有多向分化潛能，它在病理情況下可以“自發(fā)”地向損傷組織趨化，并在組織微環(huán)境作用下分化為受損腦組織特性的細(xì)胞，但確切機(jī)制尚不明確，可能和BMSC能夠表達(dá)眾多趨化因子受體和各種細(xì)胞黏附因子，以及促進(jìn)出血區(qū)各種炎癥介質(zhì)的釋放、腦細(xì)胞黏附因子的表達(dá)，調(diào)控BMSC的趨化有關(guān)。

本研究用斷尾取自體血方法制備ICH模型，治療組于術(shù)后1 h開(kāi)始給予rhGCSF治療，比較不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和治療組的NSS評(píng)分發(fā)現(xiàn)，兩組的NSS隨出血時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減輕，說(shuō)明存在神經(jīng)系統(tǒng)的自身修復(fù)，但I(xiàn)CH組NSS較治療組更嚴(yán)重，說(shuō)明僅靠神經(jīng)系統(tǒng)代償性的自身修復(fù)是不夠的，會(huì)遺留較明顯的NSS，而rhGCSF治療可以減輕NSS。

Brdu是一種嘧啶類似物，可于細(xì)胞合成期(S期)替代胸腺嘧啶摻入到細(xì)胞核內(nèi)，作為新生細(xì)胞的特異性標(biāo)記〔5〕。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后神經(jīng)干細(xì)胞可增殖分化，參與缺血性腦損傷的修復(fù)過(guò)程。

研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用5溴尿嘧啶標(biāo)記觀察細(xì)胞增殖情況時(shí)，沙土鼠在短暫全腦缺血5 min再灌注后5 d、10 d，海馬齒狀回區(qū)Brdu標(biāo)記的干細(xì)胞數(shù)目增加，提示有神經(jīng)干細(xì)胞的增殖加速，缺血性腦損傷后自身神經(jīng)干細(xì)胞具有自發(fā)活化作用〔6〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)諸多證據(jù)支持Brdu染色陽(yáng)性細(xì)胞為新生增殖細(xì)胞：如陽(yáng)性細(xì)胞多分布于腦出血灶周圍組織中;陽(yáng)性細(xì)胞可呈叢集性，提示為誘導(dǎo)分化生成而非DNA修復(fù)等。這些現(xiàn)象均表明Brdu染色陽(yáng)性細(xì)胞為新生增殖細(xì)胞。

本研究發(fā)現(xiàn)腦出血后ICH組和治療組的出血灶周邊區(qū)均可見(jiàn)Brdu陽(yáng)性細(xì)胞，尤其是第1周，灶周存在較多的Brdu陽(yáng)性細(xì)胞，提示細(xì)胞增殖活躍，rhGCSF治療可促進(jìn)腦出血損傷的細(xì)胞增殖，有促進(jìn)干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膠質(zhì)細(xì)胞增生、修復(fù)腦出血損傷的作用。

天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白激酶家族(caspases)是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最重要的蛋白酶，caspase3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶，處于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的核心位置，發(fā)揮非常重要的作用，被稱為死亡蛋白酶。如果在caspase3激活之前進(jìn)行干預(yù)，可以有效抑制凋亡的發(fā)生〔7〕。

本實(shí)驗(yàn)中，ICH后各時(shí)間點(diǎn)治療組及ICH組caspase3表達(dá)均增高，但I(xiàn)CH組均較治療組增高明顯，說(shuō)明rhGCSF治療可以減少腦出血后神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，促進(jìn)腦損傷神經(jīng)元的分化和再生，起到神經(jīng)保護(hù)的作用。

GCSF的神經(jīng)保護(hù)作用分析可能與以下機(jī)制有關(guān)：(1)抗炎癥作用：GCSF有顯著抗炎癥作用，有研究證實(shí)在大鼠短暫和持久大腦中動(dòng)脈閉塞模型中，GCSF治療組IL1β mRNA較對(duì)照組明顯減少，且GCSF能顯著減輕水腫和減小梗死體積，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)〔8〕。(2)抗凋亡作用：GCSF與腦內(nèi)GCSFR結(jié)合引起STAT3上調(diào)，后者作用于神經(jīng)元上的抗凋亡蛋白Bcl2〔9〕。(3)促進(jìn)血管生成和神經(jīng)發(fā)生：在損傷、缺血狀態(tài)下，循環(huán)干細(xì)胞選擇性遷移至缺血部位，支持受損組織的重塑和功能重建〔10〕。Shuy等〔3〕用大鼠模型證實(shí)，GCSF以化學(xué)激活這種方式動(dòng)員足量的BMSC并歸巢至腦損傷區(qū)，在腦內(nèi)分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，并促進(jìn)血管再生，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)和功能康復(fù)。這個(gè)作用能增加營(yíng)養(yǎng)因子的產(chǎn)生，如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)損傷實(shí)質(zhì)細(xì)胞的修復(fù)，提示損傷腦組織可能特異性地吸引骨髓源性細(xì)胞。因此，進(jìn)一步的探索GCSF的作用機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)新的腦卒中治療方案有重要的意義。

綜上所述，rhGCSF可動(dòng)員BMSC到外周血，在腦出血時(shí)，循環(huán)中的干細(xì)胞可以透過(guò)血腦屏障，進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)并遷移至受損腦組織，釋放某種營(yíng)養(yǎng)因子并分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，從而增加神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)其代償修復(fù)的能力。大鼠ICH后，給予rhGCSF治療可以有效促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化，改善神經(jīng)功能評(píng)分，具有神經(jīng)保護(hù)作用，為探索干細(xì)胞治療腦出血更加簡(jiǎn)便有效的方法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

1 Gound E，Reeves AJ，Grazano MS，et al.Neurogenesis in the neocortex of adult primates〔J〕.Science，1999;286(27)：54852.

2 Mezey E，Key S，Vogelsang G，et al.Transplanted bone marrow generates new neurons in human brains〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2003;100(3)：13649.

3 Shuy WC，Lin SZ，Yang HI，et al.Functional recovery of stroke rats induced by granulocyte colonystimulating factorstimulated stem cells〔J〕. Circularion，2004;28：184754.

4 Kocher AA，Schuster MD，Szabolcs MJ，et al.Neovascularization of ischemic myocardium by human bonemarrowderived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis，reduces remodeling and improves cardiac function〔J〕.Nat Med，2001;7(4)：4306.

5 Kuhn HG，DickinsonAnson H，Gage FH.Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat：agerelated decrease of neuronal progenitor proliferation〔J〕.J Neurosci，1996;16(6)：202733.

6 Jiang YH，Balkrishna N，Jahagirdar，et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow〔J〕.Nature，2002;20(1)：37.

7 Sharma S，Ravichandran V，Jain PK.Prediction of caspase3 inhibitory activity of 1，3dioxo4methyl2，3dihydro1hpyrrolo〔3，4c〕quinolines:QSAR study〔J〕.Enzyme Inhib Med Chem，2008;23(3):42431.

8 Gibson CL，Jones NC，Prior MJ，et al.GCSF suppresses edema formation and reduces interleukin1β expression after cerebral ischemia in mice〔J〕. Neuropathol Exp Neurol，2005;64(7):7639.

篇4

重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（recombinant humangranulocyte-macrophage colony stimulating factor，rhGM-CSF）是一種能調(diào)節(jié)造血祖細(xì)胞增殖分化的細(xì)胞因子，主要用于防治惡性腫瘤放療和化療所引起的白細(xì)胞減少癥，已用于臨床近許多年，取得了很好的臨床效果，但也伴有不少不同程度的不良反應(yīng)，如發(fā)熱、寒顫、疼痛、皮疹、胸痛、注射部位硬結(jié)等[1]。我院化療科1例左乳腺癌術(shù)后化療患者使用該藥后出現(xiàn)心律失常反應(yīng)，經(jīng)積極治療及護(hù)理，患者病情得到緩解，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 病例簡(jiǎn)介

患者，女，58歲，右乳腺癌術(shù)后5月，化療5療程后1月，因再次化療于2011年12月13日入院。入院時(shí)，查體：體溫36.8℃，脈搏72次/分，呼吸18次/分，血壓14.6/9.3KP。雙肺呼吸音略粗，未聞及干濕啰音；心臟無(wú)擴(kuò)大，心率72次/分，心律齊，各瓣膜聽(tīng)診區(qū)未聞及雜音。腹平軟，無(wú)壓痛，肝、脾肋下未捫及。無(wú)藥物過(guò)敏史，無(wú)高血壓、心臟病和糖尿病史。查血常規(guī)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)2.6×109/L，中性粒細(xì)胞記數(shù)40%，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)3.68×1012/L，血小板計(jì)數(shù)163×109/L。由于白細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)偏低，入院后當(dāng)日開(kāi)始給予患者皮下注射重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-GSF，由北京北醫(yī)聯(lián)合藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，商品名健白，國(guó)藥準(zhǔn)字S20063097，規(guī)格為200μg/支，無(wú)菌凍干粉劑，批號(hào)20110801） ，一日一次，一次400μg，共7次。首次皮下注射后無(wú)任何異常，第三次注射15min后，患者出現(xiàn)輕微的胸部不適、呼吸加快等現(xiàn)象，靜坐休息15min后癥狀完全消失，隨后減量為一日一次，一次200μg，用藥第5日晨查房時(shí)，體格檢查發(fā)現(xiàn)脈搏75次/分，節(jié)律不整齊；心臟聽(tīng)診：心率75次/分，心律不整齊，頻發(fā)期前收縮；各瓣膜聽(tīng)診區(qū)未聞及雜音；查心電圖示頻發(fā)房性早搏（二聯(lián)律），病人訴每次用藥后可有短暫性胸悶、頭暈、心悸等現(xiàn)象，當(dāng)即考慮可能為應(yīng)用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落因子所引起的不良反應(yīng)，于是立即停藥并給予相應(yīng)抗心律失常處理，升白細(xì)胞藥物改為口服升白細(xì)胞藥物（如維生素B4、鯊肝醇、利血生），同時(shí)密切觀察病人生命體征及病情變化；預(yù)防快速性室上性心律失常及心功能衰竭。病人休養(yǎng)1周后體格檢查發(fā)現(xiàn)脈搏72次/分，律齊；心臟聽(tīng)診：心率72次/分，律齊，各瓣膜聽(tīng)診區(qū)未聞及雜音；心電圖示恢復(fù)竇性正常心律。復(fù)查血常規(guī)：白細(xì)胞記數(shù)4.8×109/L，中性粒細(xì)胞記數(shù)68%，順利完成此次化療。

2 討論

rhGM-GSF作用于造血祖細(xì)胞促進(jìn)其增殖和分化，其重要作用是刺激粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞成熟，促進(jìn)成熟細(xì)胞向外周血釋放，為解決腫瘤化療后的骨髓抑制這一難題提供了有效手段[3]。rhGM-GSF的安全性與劑量和給藥途徑有關(guān)，其不良反應(yīng)主要為少數(shù)病人有發(fā)熱、皮疹、骨痛、胸痛、寒戰(zhàn)、流涕和腹瀉及注射局部反應(yīng)（如紅腫、硬結(jié)等）。有報(bào)道稱此藥引起罕見(jiàn)的不良反應(yīng)有變態(tài)反應(yīng)、支氣管痙攣、心力衰竭等。

本例患者無(wú)高血壓、冠心病、心肌病、風(fēng)濕性心臟病病史，詢問(wèn)近期內(nèi)也無(wú)感冒、發(fā)熱、腹瀉病史及患急性病毒性心肌炎和應(yīng)用洋地黃類藥物、抗心律失常藥物及利尿劑等藥物。本例患者給藥途徑是按照正規(guī)給藥途徑，使用該藥物時(shí)經(jīng)多人核對(duì)后未發(fā)現(xiàn)藥物過(guò)期，制劑中無(wú)雜質(zhì)，與劑量無(wú)關(guān)，患者在以前化療過(guò)程中均是采用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）來(lái)提升白細(xì)胞。綜合考慮認(rèn)為，本例患者在使用rhGM-CSF第五天出現(xiàn)房性早搏應(yīng)是一例罕見(jiàn)不良反應(yīng)，但是否與rhGM-CSF引起的變態(tài)反應(yīng)有關(guān)，需要做進(jìn)一步研究。房性早搏的治療大多不需特殊治療，只需密切觀察病情變化即可，有癥狀者宜解除顧慮及緊張過(guò)度情緒或試用鎮(zhèn)靜劑和β-受體阻滯劑以減少運(yùn)動(dòng)可，快速心室率者可選用抗心律失常藥物治療，房性和房室交接處早搏大多選作用于心房和房室交接處的Ⅰa、Ⅰc、Ⅱ、Ⅳ類藥，而室性早搏則多選用作用于心室的Ⅰ類和Ⅲ類藥[4]。

綜合文獻(xiàn)，關(guān)于rhGM-CSF導(dǎo)致的不良反應(yīng)的報(bào)道，現(xiàn)總結(jié)如下：.肌肉骨骼系統(tǒng)，偶有肌肉酸痛、骨痛、腰痛、胸痛、關(guān)節(jié)痛；消化系統(tǒng)，偶會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、食欲不振和腹瀉的現(xiàn)象，或肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶升高、偶見(jiàn)血清白蛋白水平低下；神經(jīng)系統(tǒng)，偶有頭疼、精神失常、腦血管疾病、驚厥甚至癲癇；其他，部分患者出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)、流涕、心悸、胸悶、乏力及皮疹，血清尿酸、乳酸脫氫酶及堿性磷酸酶增高升高；罕見(jiàn)的反應(yīng)有變態(tài)反應(yīng)、呼吸困難、肺水腫、暈厥、間質(zhì)性肺炎和幼稚細(xì)胞增加等。嚴(yán)重者可見(jiàn)支氣管痙攣、成人呼吸窘迫綜合征、室上性心律失常、心力衰竭、休克、心包炎、血栓形成[5]。

參考文獻(xiàn)

[1] 梅其炳，蔣永培.臨床新藥手冊(cè)[M].北京：清華大學(xué)出版社，2006：496.

[2] 李煥德，趙緒元，張超.臨床實(shí)用新藥[M].北京人民衛(wèi)生出版社，2007：389-399.

[3] 董梅、馮奉儀，綜述，腫瘤化療輔助藥研究進(jìn)展. 國(guó)外醫(yī)學(xué)，腫瘤學(xué)分冊(cè)，2002， 29（1）： 22.

篇5

[關(guān)鍵詞] 金屬烤瓷冠；鎳鉻合金；鈷鉻合金；鈦合金；牙周組織

[中圖分類號(hào)] R783.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）02（a）-0054-04

Effect of different porcelain fused metal crown on periodontal tissues and cytokines in gingival crevicular fluid

XU Xiaoxia1 LI Lifeng2

1.Department of Stomatology， Armed Police Force Hospital of Jiaxing City， Zhejiang Province， Jiaxing 314000，China； 2.Department of Stomatology， People's Hospital of Fuyang City， Zhejiang Province， Fuyang 311400， China

[Abstract] Objective To explore the effect of different porcelain fused metal crown on periodontal tissues and cytokines in gingival crevicular fluid. Methods 90 patients with 90 teeth according to different porcelain crowns metallic materials were divided into three groups： Ni-Cr alloy porcelain fused metal crown group， Co-Cr alloy group and Ti-Lite alloy porcelain fused metal crown group， each group had 30 patients， while their own side of the same name healthy natural teeth were taken as benchmark for comparison. The effect of three porcelain fused metal crowns on gum and the PLI， SBI， PD， VEGF， IL-1β， TNF-α of offending teeth and healthy teeth in three groups were compared after repaired for 12 months. Results The repaired teeth in the three groups had higher PLI， SBI and PD than healthy teeth after 12 months （P < 0.05）； SBI and PD in Ni-Cr alloy group and Co-Cr alloy group were higher than Ti-Lite alloy group （P

[Key words] Porcelain fused metal crown； Ni-Cr alloy； Co-Cr alloy； Ti-Lite alloy； Periodontal tissue

金屬烤瓷冠（PFM）在口腔修復(fù)學(xué)中是烤瓷熔附金屬也稱金屬烤瓷全冠。1887年Land發(fā)現(xiàn)把陶瓷熔結(jié)在鉑上的方法，首先制作了原始形式的金屬烤瓷?？敬扇鄹浇饘偃冢ê?jiǎn)稱“烤瓷冠”）已經(jīng)成為目前牙冠修復(fù)的重要方式[1]，它是用低熔瓷與金屬底層材料聯(lián)合制成的修復(fù)體，能較好恢復(fù)牙體形態(tài)、功能?？敬晒谑怯兄鴱?qiáng)度高、外觀逼真、色澤穩(wěn)定、表面光滑、不易磨損、耐酸堿、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)的永久性修復(fù)體，兼有金屬的強(qiáng)度和烤瓷的美觀，所以深受醫(yī)師和患者的歡迎和青睞。不同的烤瓷材料會(huì)對(duì)牙周組織產(chǎn)生不同的影響，這些影響反映在修復(fù)之后，出現(xiàn)牙齦出血、齦緣黑線牙齦紅腫、牙周損傷等現(xiàn)象[2]。這種癥狀嚴(yán)重地影響了牙冠修復(fù)治療的長(zhǎng)期效果。近年來(lái)烤瓷冠修復(fù)之后可能引起的牙周組織炎癥問(wèn)題，越來(lái)越被臨床醫(yī)師重視。本文探究不同金屬烤瓷冠修復(fù)對(duì)牙周組織及牙齦溝周圍細(xì)胞因子的影響，為臨床修復(fù)工作提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年4月于浙江省嘉興市武警醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）就診并且準(zhǔn)備進(jìn)行烤瓷冠修復(fù)治療的90例患者共90顆牙齒為研究對(duì)象，其中，男43例，女47例；年齡20～55歲，平均（32.5±8.9）歲。根據(jù)烤瓷冠金屬材料不同將患者分為鎳鉻合金組、鈷鉻合金組和鈦合金組。鎳鉻合金組30例患者中，男17例，女13例；年齡16～67 歲，平均（35.8±4.6）歲。鈷鉻合金組30例患者中，男16例，女14例；年齡13～66歲，平均（35.4±4.7）歲。鈦合金組30例患者中，男19例，女11例；年齡17～69 歲，平均（36.1±5.1）歲。各組年齡及性別比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），具有可比性。所有患者符合以下條件：患牙位置均分布在上頜的前牙區(qū)部分；患者無(wú)牙齦紅腫現(xiàn)象；牙周組織健康，沒(méi)有先天畸形；患者的前牙區(qū)能基本保證正常咬合關(guān)系；患者患牙的對(duì)側(cè)同名牙均為健康天然牙齒；在進(jìn)行烤瓷冠修復(fù)后一直到標(biāo)本采集前半年內(nèi)，不能服用抗生素累藥品；進(jìn)行過(guò)牙周治療并要求進(jìn)行牙冠修復(fù)的患者；全身沒(méi)有系統(tǒng)性疾病，如心血管疾病、糖尿病、肝炎和血液性疾病等；有較好的口腔衛(wèi)生狀況，無(wú)牙齦炎等口腔疾病?？敬晒诮揭粋?cè)、近中邊緣深入到齦下0.5 mm左右，大概位于齦溝深的一半，舌側(cè)與齦緣保持平整對(duì)齊，佩戴烤瓷冠以后，進(jìn)行邊緣適合性檢查，采用改良技術(shù)Ryge標(biāo)準(zhǔn)[3]，本研究所有烤瓷冠修復(fù)體的邊緣適合度均為Α級(jí)。本研究從計(jì)劃到實(shí)施均由筆者嚴(yán)格按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床牙體準(zhǔn)備、修復(fù)、試冠、黏固以及調(diào)整并整形，保證了技術(shù)方面的標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一。所有患者均了解手術(shù)過(guò)程及風(fēng)險(xiǎn)，并且在清醒和知情的情況下同意并且簽署了烤瓷冠修復(fù)同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 烤瓷冠修復(fù) 按烤瓷冠要求制備牙體，避免損傷牙齦，頸緣位置為齦下0.5 mm，肩臺(tái)寬度為0.5～1.0 mm，排齦后用硅橡膠印模材取模，臨時(shí)冠修復(fù)。根據(jù)分組分別采用鎳鉻合金、鈷鉻合金和鈦合金制作PFM全冠。密合性、牙冠軸面外形等可能影響基牙牙周健康，所有操作均由同一醫(yī)師及同一組技工完成。

1.2.2 牙周臨床檢查 修復(fù)完成后12個(gè)月對(duì)患者的修復(fù)牙齒進(jìn)行臨床檢查?；佳篮蛯?duì)照牙的菌斑指數(shù)（plaque index，PLI）檢測(cè)采用Quigley-Hein法，齦溝出血指數(shù)（sulcus bleeding index，SBI）檢測(cè)采用Loe和Silness法，記錄探診深度（probing depth，PD）。上述檢查指標(biāo)中，除菌斑指數(shù)外，每牙檢查唇舌側(cè)近中、中央、遠(yuǎn)中，取6個(gè)位點(diǎn)的平均值作為最終檢查結(jié)果。

1.2.3 牙齒齦溝液標(biāo)本的提取 烤瓷冠修復(fù)的前后，提取牙齒齦溝液：由口腔內(nèi)科專業(yè)醫(yī)師，在提取牙齒牙齦液之前，對(duì)患者進(jìn)行口腔清理，用清水漱口3次，每次30 s。清理完畢以后，等待15～20 min后再行取液，使用濾紙條進(jìn)行齦溝液采集，每例患者每顆牙取液3次，每次使用1張濾紙條，并且每次取液間隔時(shí)間為5 min。將取好齦溝液的濾紙條放置在齦溝液儀中進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取并記錄示數(shù)。

1.2.4 齦溝液血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）濃度檢測(cè) 使用ELISA法對(duì)樣本的VEGF濃度進(jìn)行檢測(cè)，將2000 ng/L的VEGF標(biāo)準(zhǔn)品使用二倍稀釋法稀釋成濃度分別為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 ng/L，將濃度樣本依次加入到VEGF試劑盒的多孔板中，37℃恒溫箱中孵育3 h，洗板5次，然后加入少量抗工作液孵育2 h，洗板5次，并且向其中加入酶標(biāo)抗體工作液再孵育1 h，此時(shí)要注意洗板6次，然后進(jìn)行清洗，洗凈以后加入少量底物工作酶，樣本避光孵育5～15 min，最后加入終止反應(yīng)液，終止反應(yīng)。終止后即可在HTS 7000 Plus多孔板上進(jìn)行測(cè)量，使用高效分析儀測(cè)量并記錄數(shù)據(jù)，波長(zhǎng)為492 nm。

1.2.5 齦溝液中白介素（IL）- 1β和腫瘤壞死因子（TNF）-α水平檢測(cè) 采用雙抗體夾心ELISA法對(duì)齦溝液中IL-1β及TNF-α水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種烤瓷冠修復(fù)后12個(gè)月牙周檢查結(jié)果

修復(fù)后12個(gè)月三組修復(fù)牙PLI、SBI、齦溝PD與對(duì)照牙比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05），修復(fù)后三組PLI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），鈦合金組SBI和PD與鎳鉻合金組、鈷鉻合金組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 三種烤瓷冠修復(fù)后12個(gè)月齦溝液細(xì)胞因子比較

三種烤瓷冠修復(fù)牙VEGF、IL-1β、TNF-α水平較對(duì)照牙顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；鈦合金組修復(fù)牙VEGF、IL-1β、TNF-α水平低于鎳鉻合金組和鈷鉻合金組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

金屬烤瓷冠是鑲牙的一種，將牙齒的外表面根據(jù)設(shè)計(jì)要求磨除一層后，選用金屬作為內(nèi)層牙冠，然后用牙科專用瓷性材料高溫?zé)Y(jié)在金屬的表面，達(dá)到恢復(fù)牙齒的外形、功能和美觀的目的，也被稱為金屬烤瓷全冠，它是用低熔瓷與金屬底層材料聯(lián)合制成的修復(fù)體，兼有金屬的強(qiáng)度和瓷的美觀，而且能較好恢復(fù)牙體形態(tài)、功能，是強(qiáng)度高、外觀逼真、色澤穩(wěn)定、表面光滑、不易磨損、耐酸堿、生物相容性好的永久性修復(fù)體。現(xiàn)代牙科中鎳鉻合金是口腔重要的修復(fù)材料，而且在臨床上廣泛應(yīng)用。由于鑄造所需的成本低，價(jià)格便宜，技術(shù)成熟，更容易被絕大多數(shù)患者所接受。有研究發(fā)現(xiàn)，口腔中的唾液會(huì)使鎳鉻合金析出的離子產(chǎn)生毒性作用，這會(huì)危害到口腔組織的細(xì)胞活性，進(jìn)而影響牙周組織的正常健康和代謝[4-5]。

臨床上進(jìn)行治療的過(guò)程中，對(duì)于口腔中需要使用烤瓷冠的患者，醫(yī)生會(huì)根據(jù)患者的要求及條件挑選具有一定的抗腐蝕性的金屬材料，由于人類的口腔環(huán)境比較復(fù)雜，所以烤瓷內(nèi)冠在口腔的環(huán)境中會(huì)發(fā)生腐蝕作用，牙齒的腐蝕不但會(huì)影響烤瓷的美觀，而且還會(huì)對(duì)牙周組織及基牙產(chǎn)生刺激[6-7]?？敬晒诘男迯?fù)效果主要依靠于患者牙周組織的健康情況[8-9]。有研究表明，金屬烤瓷全冠中的合金材料浸入到唾液中會(huì)發(fā)生電化學(xué)腐蝕，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致金屬離子的解離并且析出，而金屬離子的析出則會(huì)引起人體牙周組織的免疫反應(yīng)，進(jìn)而會(huì)使一些炎癥因子以及酶等從牙齦溝中被釋放出來(lái)，從而引發(fā)局部的發(fā)炎癥狀[10-11]。測(cè)定齦溝液中IL-1β和TNF-α水平，可作為檢測(cè)牙齦炎和牙周炎進(jìn)展的有效而無(wú)創(chuàng)性方法。VEGF是強(qiáng)而有力的血管生成劑，一旦血管密度變高，VEGF的表達(dá)也隨之增加[12]。齦溝液分泌增多是牙齦炎癥早期的主要表現(xiàn)之一。牙齦狀況的改變會(huì)通過(guò)齦溝液量的變化而發(fā)生改變，因此通過(guò)準(zhǔn)確檢測(cè)齦溝液量就可以正確地判斷牙齦的健康狀況是否發(fā)生改變。

本研究牙周檢查中，鎳鉻合金烤瓷冠修復(fù)的患牙指標(biāo)有不同程度的增加（PD、SBI），可作為輔助判斷牙周組織破壞的依據(jù)；不同金屬烤瓷冠修復(fù)后，齦溝液中的細(xì)胞因子VEGF、IL-1β及TNF-α的水平發(fā)生變化，提示牙齦健康狀況有改變。研究結(jié)果顯示，修復(fù)后12個(gè)月患牙PLI、SBI、齦溝PD明顯升高，與對(duì)照牙比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05），修復(fù)后三組PLI無(wú)明顯差異，鈦合金組SBI和齦溝PD與鎳鉻合金組、鈷鉻合金組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。三種烤瓷冠修復(fù)牙VEGF、IL-1β及TNF-α水平較對(duì)照牙顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 而鈦合金組修復(fù)牙VEGF、IL-1β及TNF-α水平低于鎳鉻合金組和鈷鉻合金組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。提示鈦合金對(duì)患者具有更好的療效。孫平等[13]認(rèn)為，鈷鉻合金具有較好的生物相容性。從本研究數(shù)據(jù)可以對(duì)比看出，在修復(fù)作用鈷鉻合金優(yōu)于鎳鉻合金，但是相比鈦合金來(lái)說(shuō)，仍較差。鈦合金作為惰性金屬，其電解發(fā)生較慢，對(duì)人體的排斥性、危害性較低。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)探究了不同金屬烤瓷冠修復(fù)對(duì)牙周組織及齦溝周圍細(xì)胞因子的影響，并進(jìn)行了簡(jiǎn)單評(píng)價(jià)，若廣泛應(yīng)用于臨床推廣還需更深一步的研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 巢永烈.口腔修復(fù)學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：58-70.

[2] 劉夢(mèng)桃， 賈安琦.鎳鉻合金烤瓷修復(fù)體對(duì)局部牙齦組織損傷的機(jī)制[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：口腔醫(yī)學(xué)分冊(cè)，2004，31（1）：44-45.

[3] Ryge G. Clinical criteria [J]. Int Dent J，1981，30（3）：347.

[4] Yfantis C，Yfantis D，Anastasso J，et al. Analytical and lector chemical evaluation of thein vitrocorrosion behavior of nickel-chiomeand cobalt-chrome casting alloys for metal ceramic restorations [J]. Eur J Prosthodont Restor Dent，2007， 15（1）：33-40.

[5] Lin HY，Bowers B，Wolan JT，et al. Metallurgica，l surface and corrosion analysis of Ni-Cr dental casting alloys before and after porcelainfiring [J]. Dent Mater，2008，24（3）：378-385.

[6] Grimanudo NJ. Biocompatibility of nickel and cobalt dental alloys [J]. Gen Dent，2001，49（5）：498-503.

[7] Berzins DW，Kawashima I，Graves R，et al. Electrochemical characteristics of high-Pd-alloys in relation to Pd-allergy [J]. Dent Mater，2000，16（4）：266-273.

[8] Gallucci GO，Grütter L，Nedir R，et al. Esthetic outcomes with porcelain-fused-to-ceramic and all-ceramic single-implant crowns：a randomized clinical trial [J]. Clin Oral Impl Res，2011，11（1）：62-69.

[9] Naumann M，Ernst J，Reich S，et al. Galvano-vs. metal-ceramic crowns：up to 5 -year results of a randomized split -mouth study [J]. Clinical Oral Investigations，2011，15（5）：657-660.

[10] Sjogren G，Sletten G，Dahl JE. Cytoxicity of dental alloys，metals，and ceramics assessed by Millipore filter，agar over lay，and MTT tests[J]. Prosthet Dent，2000，84（2）：229-236.

[11] López JF，Martinez GJ，Anglada JM，et al. Ion release from dental casting alloys as assessed by a continuous flow system：Nutritional and toxicological implications [J]. Dent Ma ter，2006，22（9）：832-837.

[12] Kiselyov A，Balakin KV，Tkachenko SE. VEGF/VEGFR signallingas a targel for inhibiting angiogenesis [J]. Expert opin Investing Drugs，2007，16（1）：83-107.

篇6

[關(guān)鍵詞]重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子；凍干粉針劑；高效液相色譜法

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）05（c）-0104-04

[Abstract]Objective To establish the method of the main active ingredients in recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor freeze-dried powder injection （rhGM-CSF） by HPLC.Methods The chromatographic condition of HPLC was chromatographic column （TSK gel G3000SW，300.0 mm×7.5 mm，5 μm），Mobile phase was 0.1 mol/L phosphate buffer，F(xiàn)low rate was 1 ml / min，automatic sampling was 20-40 μl and detection wavelength was 280 nm.Analyzing the ingredients of rhGM-CSF freeze dried powder injection，reproducibility and linear relationship between different sample volume and peak area of each component under this chromatographic condition were studied in this experiment.Results The main components of rhGM-CSF freeze dried powder injection were rhGM-CSF protein and human albumin.The rhGM-CSF protein sample volume and peak area were good linear （R2>0.99） and the percentage content of RSD values was less than 3%.Conclusion This method could be used to detect the active component content of the rhGM-CSF lyophilized powder for injection protein with 10-20 μg scope.

[Key words]Recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor；Freeze-dried powder injection；High performance liquid chromatography

重M人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子凍干粉針劑（rhGM-CSF）是使用重組基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組蛋白藥物[1]343-344，是一種細(xì)胞因子，主要用于治療因放、化療引起的白細(xì)胞減少[2-5]，并且臨床上可以治療潰瘍、燙傷、燒傷等創(chuàng)面疾病[6-9]，其活性成分為重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子，該品種已被《中國(guó)藥典》三部收載[1]343-344?！吨袊?guó)藥典》未規(guī)定其成品的含量測(cè)定方法，只要求測(cè)定生物學(xué)活性（效價(jià)），采用的是TF-1依賴細(xì)胞株，用MTT染色法進(jìn)行測(cè)定，合格范圍是標(biāo)示活性的80%～150%[10]96-98，277-279。由于活性測(cè)定方法本身的穩(wěn)定性較差，難以實(shí)現(xiàn)精確的控制，因此，為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，宜盡早建立其主藥成分含量測(cè)定方法。

高效液相色譜法（HPLC）中收載rhGM-CSF原液純度的檢測(cè)方法，是采用凝膠色譜柱為固定相，磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，在波長(zhǎng)280 nm處進(jìn)行檢測(cè)，使用面積歸一化法計(jì)算目的蛋白百分比含量[10]59-63。目前，高效液相用于藥品的定性、定量的分析應(yīng)用已經(jīng)很廣泛[11-15]，但是用于檢測(cè)rhGM-CSF凍干粉針劑主藥含量的方法尚罕見(jiàn)報(bào)道，故本研究通過(guò)參考藥典中rhGM-CSF原液純度檢測(cè)的方法，確認(rèn)該法檢測(cè)rhGM-CSF凍干粉針劑主藥含量的可行性。

1材料與試藥

1.1儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（配有G1315B DAD 檢測(cè)器、G1311A四元梯度泵、G1322A在線脫氣裝置、G1316A柱溫箱，德國(guó)安捷倫科技有限公司）；化學(xué)工作站（ChemStation，版本號(hào)：Rev.A.10.01[1635]，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；BS124S型電子天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；TSK gel G3000 SWXL色譜柱（7.8 mm×300 mm，粒徑5 μm，日本東曹株式會(huì)社公司）。

1.2主要試劑

二水磷酸氫二鈉（AR，西隴化工股份有限公司）；氯化鈉（AR，廣州化學(xué)試劑廠）；十二水合磷酸二氫鈉（AR，西隴化工股份有限公司）；甲醇（色譜級(jí)，Merck KGaA）；人血白蛋白（注射級(jí)，上海萊士血液制品股份有限公司）；甘露醇注射液（注射級(jí)，華潤(rùn)雙鶴藥業(yè)股份有限公司）；PEG4000（藥用級(jí)，南京威爾化工有限公司）。

rhGM-CSF原液（批號(hào)20151003，廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司自制）。rhGM-CSF凍干粉針劑（批號(hào)20130201，規(guī)格100 μg/瓶，廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司自制）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：TSK gel G3000 SWXL（十二水磷酸二氫鈉6.08 g、十二水合磷酸氫二鈉21.85 g、氯化鈉5.844 g，三者定容至1000 ml，搖勻。經(jīng)0.45 μm的濾膜過(guò)濾后備用；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：1 ml/min；柱溫：25℃。

2.2樣品準(zhǔn)備

用流動(dòng)相將rhGM-CSF凍干粉針劑和人血白蛋白配制成濃度為0.5 mg/ml的溶液；將rhGM-CSF原液制備成濃度為1.0 mg/ml的溶液；甘露醇注射液稀釋成20%的濃度后備用。以上樣品進(jìn)樣前需經(jīng)過(guò)離心（10 000 r/min，5 min）后，取上清液適量體積加入進(jìn)樣小瓶備用。

2.3 rhGM-CSF凍干粉針劑中的各組分HPLC分析

rhGM-CSF凍干粉針劑主要由rhGM-CSF原液（主成分為rhGM-CSF蛋白）、人血白蛋白、甘露醇注射液組成。分別取1.0 mg/ml rhGM-CSF原液、0.5 mg/ml人血白蛋白、20%的甘露醇注射液?jiǎn)谓M分以及0.5 mg/ml rHGM-CSF凍干粉針劑進(jìn)行HPLC分析，進(jìn)樣體積分別為20 μl。根據(jù)HPLC圖譜確立rhGM-CSF凍干粉針劑中各組分對(duì)應(yīng)的峰及其保留時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)圖1～圖4。

檢測(cè)結(jié)果顯示，rhGM-CSF原液于11.072 min出現(xiàn)吸收峰，人血白蛋白于5.824、8.296、9.399、14.756、15.021 min出現(xiàn)吸收峰，甘露醇注射液于12～13 min出現(xiàn)了倒峰。RHGM-CSF凍干粉針劑則在5.843、8.274、9.396、10.999、14.900 min出現(xiàn)吸收峰，在12～13 min也出現(xiàn)了倒峰。結(jié)合HPLC分析方法自身的系統(tǒng)誤差，推測(cè)rhGM-CSF凍干粉針劑中保留時(shí)間為5.843、8.274、9.396、14.900 min的吸收峰是人血白蛋白的不同聚合體的樣品峰。人血白蛋白單組分在保留時(shí)間為14.756、15.021 min時(shí)出現(xiàn)了兩個(gè)吸收峰，推測(cè)以液體和凍干粉狀態(tài)貯存的人血白蛋白的穩(wěn)定性存在差異，導(dǎo)致其注射液經(jīng)長(zhǎng)期存放后出現(xiàn)了分裂峰。12～13 min的倒峰推測(cè)為甘露醇，由于甘露醇吸光度小于流動(dòng)相導(dǎo)致了倒峰的產(chǎn)生，表明該體系不適用于甘露醇的分析。rhGM-CSF凍干粉針劑中保留時(shí)間為10.999 min的單峰推測(cè)為rhGM-CSF目的蛋白。

2.4 rhGM-CSF凍干粉針劑結(jié)果的重現(xiàn)性

取0.5 mg/ml的rhGM-CSF凍干粉針劑（批號(hào)20130201），平行進(jìn)樣3次，進(jìn)樣體積40 μl（對(duì)應(yīng)rhGM-CSF蛋白的含量為20 μg），根據(jù)面積歸一化法計(jì)算各組分的峰面積（area）及相應(yīng)的百分含量（area%），并計(jì)算其RSD（%）。結(jié)果顯示，該法分析rhGM-CSF凍干粉針劑，各峰的平行性較好，峰面積及峰面積百分比RSD均

2.5不同進(jìn)樣體積與各組分峰面積的線性關(guān)系

取制備好的0.5 mg/ml rhGM-CSF凍干粉針劑（批號(hào)20161201），根據(jù)不同進(jìn)樣體積的分析結(jié)果，如不同進(jìn)樣量的各峰的保留時(shí)間、峰面積、百分含量及相應(yīng)的RSD值，研究不同進(jìn)樣量與相應(yīng)峰面積的線性關(guān)系（進(jìn)樣量為20～40 μl，對(duì)應(yīng)10～20 μg的rhGM-CSF蛋白）。

2.5.1 rhGM-CSF凍干粉針劑中第1個(gè)峰（人血白蛋白）的HPLC分析 保留時(shí)間約為5.8 min的HPLC分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，不同的進(jìn)樣體積與各組分的百分含量進(jìn)行擬合線性回歸，R2值為0.9999。

2.5.2 rhGM-CSF凍干粉針劑中第2個(gè)峰（人血白蛋白）的HPLC分析 保留時(shí)間約為8.2 min的HPLC分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，不同的進(jìn)樣體積與各組分的百分含量進(jìn)行M合線性回歸，R2值為0.9979。

2.5.3 rhGM-CSF凍干粉針劑第3個(gè)峰（人血白蛋白）的HPLC分析 保留時(shí)間為9.3 min的HPLC分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表4，不同的進(jìn)樣體積與各組分的百分含量進(jìn)行擬合線性回歸，R2值為1。

2.5.4 rhGM-CSF凍干粉針劑第4個(gè)峰（rhGM-CSF蛋白）的HPLC分析 保留時(shí)間約為11.0 min的HPLC分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表5，不同的進(jìn)樣體積與各組分的百分含量進(jìn)行擬合線性回歸，R2值為0.9999。

2.5.5 rhGM-CSF凍干粉針劑第5個(gè)峰（人血白蛋白）的HPLC分析 保留時(shí)間為14.9 min的HPLC分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表6，不同的進(jìn)樣體積與各組分的百分含量進(jìn)行擬合線性回歸，R2值為0.9964。

3討論

3.1蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法比較

蛋白質(zhì)含量測(cè)定法[10]96-98主要有凱氏定氮法、lowry法、雙縮脲法、考馬斯亮藍(lán)（Brandford）法、BCA法、紫外-可見(jiàn)分光光度法等，其中凱氏定氮法與雙縮脲法需要較大量的蛋白樣品，并且雙縮脲法需要蛋白濃度也較高；紫外吸收法測(cè)定低濃度的蛋白時(shí)準(zhǔn)確度較差；考馬斯亮藍(lán)G-250染色（Brandford）法一般只用于蛋白粗略定量。上述蛋白測(cè)定方法屬于非特異性的反應(yīng)，當(dāng)產(chǎn)品有蛋白類添加劑（比如人血白蛋白）時(shí)就完全不適用。并且重組蛋白藥物劑量很小，一般為微克級(jí)，需要應(yīng)用更靈敏的檢測(cè)方法。

3.2 HPLC檢測(cè)法對(duì)混合組分的適用性

本文采用HPLC法對(duì)rhGM-CSF 凍干粉針劑及其單組分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該法可檢測(cè)出rhGM-CSF凍干粉針劑中的主成分rhGM-CSF蛋白和人血白蛋白，各峰之間的分離度較好；HPLC方法的重現(xiàn)性較好，相同進(jìn)樣體積條件下，其峰面積及峰面積百分比的RSD均0.99，故該法可用于檢測(cè)rhGM-CSF凍干粉針劑中的活性成分的含量百分比。另外，由于不同樣品的峰面積與其進(jìn)樣量呈一定的線性關(guān)系，還可在一定范圍內(nèi)根據(jù)rhGM-CSF蛋白峰面積的變化，推測(cè)其對(duì)應(yīng)的含量。

應(yīng)用HPLC法檢測(cè)rhGM-CSF凍干粉針劑中rhGM-CSF含量，是原液評(píng)價(jià)的一種直觀、合理、有效的技術(shù)手段，具有重現(xiàn)性好和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，能很好地滿足質(zhì)控的要求，對(duì)完善該品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。

[參考文獻(xiàn)]

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].三部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：343-344.

[2]陳玉林，楊長(zhǎng)福，韋華軍，等.重組人粒細(xì)胞刺激因子、重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子對(duì)腫瘤患者化療后升高白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞效果的比較[J].吉林醫(yī)學(xué)，2016，37（2）：323-324.

[3]雷雙根，余小芬，謝春偉，等.重組人粒細(xì)胞集落刺激因子治療乳腺癌術(shù)后化療后骨髓抑制的療效[J].實(shí)用臨床醫(yī)學(xué)，2014，15（7）：28-30.

[4]秦凌陽(yáng)，晁占湖，閆懷蓮.短期應(yīng)用重組人粒細(xì)胞刺激因子注射液治療兒童中性粒細(xì)胞減少癥的臨床研究[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2014，8（4）：153-154.

[5]李北兵，白明，楊瑩.重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的研究進(jìn)展綜述[J].黑龍江醫(yī)藥，2010，23（3）：407-408.

[6]易吉秀.重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子治療早期糖尿病足潰瘍療效觀察[J].中國(guó)藥房，2011，22（10）：909-911.

[7]蔡景寧，孫玉靜，謝曉繁，等.重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子凝膠對(duì)深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面溶痂的效果分析[J].中國(guó)臨床醫(yī)生雜志，2017，45（1）：39-42.

[8]邱學(xué)文，盛穎萍，王甲漢，等.聯(lián)合應(yīng)用rhGM-CSF和莫匹羅星于燒傷后殘余創(chuàng)面的療效觀察[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2016，36（9）：748-784.

[9]李霞，楊文芳.重組人粒細(xì)胞集落刺激因子聯(lián)合護(hù)理治療放射性口腔炎療效觀察[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013， 22（2）：209-210.

[10]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].四部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[11]趙輝，李增禮，周樂(lè)春，等.HPLC法測(cè)定重組人干擾素α2b注射液中吐溫80的含量[J].中國(guó)生物制品W雜志，2012，25（5）：623-629.

[12]劉璐，蔡峰，王公孝，等.A群C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗游離蛋白含量HPLC檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2016，29（11）：1200-1204.

[13]田宇柔，甄亞欽，王鑫國(guó)，等.半枝蓮配方顆粒HPLC指紋圖譜及含量測(cè)定方法研究中國(guó)藥學(xué)雜志[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2016，29（20）：1795-1799.

[14]畢嘉益，蘆紅代，程思謨，等.HPLC法測(cè)定枸櫞酸西地那非原料藥的含量及有關(guān)物質(zhì)[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015， 32（7）：527-530.

篇7

[關(guān)鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；骨組織工程；細(xì)胞膜片；磷酸三鈣

[中圖分類號(hào)]R318[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2011）03-0408-03

Engineering bone tissue using bone marrow mesenchymal stem cell sheet and β-tricalcium phosphate ceramic

MA Dong-yang1,MA Jing2,JIANG Dong-hong3,WANG Jian-feng3

(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,2. Department of Otolaryngology,3. Department of Medical Administration，Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA,730052,Gansu,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility of constructing bone tissue using bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC) sheet and β-tricalcium phosphate ceramic (TCP).MethodsWe first harvested a cell sheet from rabbit BMSCs using a continuous culture method and a scraping technique. The cell sheet was then wraped around a cylinder of β-TCP. Finally,the constructs were implanted into the subcutaneous pockets of nude mice for in vivo experiments. Gross view and histological examinations were performed to evaluate the harvested specimens. Results The cell sheet, with an average thickness of 158 mm, was composed of multi-layered cells separated in the extracellular matrix. Six weeks after implantation, the new bone tissue was present both on the edge and at the center of the TCP in sheet-TCP group. A layer of woven bone formed in the cell-sheet group. In contrast, the TCP was filled only with fibrous tissue in the TCP group,without evidence of bone formation.ConclusionThe study indicates that the combination of osteogenic BMSC sheet and β-TCP ceramic can engineer bone tissue and the engineered construct might be considered as a promising substitute for bone repair.

Key words:bone mesenchymal stem cell; bone tissue engineering; cell sheet; β-tricalcium phosphate

近年來(lái)，隨著再生醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，組織工程有望為骨缺損提供理想的修復(fù)方法[1]。組織工程骨的傳統(tǒng)構(gòu)建方法是將具有成骨分化功能的種子細(xì)胞與三維支架材料復(fù)合[1-2]。細(xì)胞在體外擴(kuò)增后常用胰蛋白酶消化成離散細(xì)胞懸液，在此過(guò)程中，細(xì)胞自分泌的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞-基質(zhì)連接、以及細(xì)胞-細(xì)胞連接等結(jié)構(gòu)都被破壞，而這些結(jié)構(gòu)對(duì)于細(xì)胞分化、特異性表型維持、分泌、組織形成等功能非常重要[3]。再者，細(xì)胞與支架材料直接復(fù)合的方法存在細(xì)胞利用率低的缺點(diǎn)[4]。為了解決上述問(wèn)題，我們提出新的組織工程構(gòu)建策略，即應(yīng)用細(xì)胞膜片與可降解的外源性支架材料復(fù)合來(lái)構(gòu)建工程化骨組織。為驗(yàn)證這一構(gòu)想，本研究選用來(lái)源豐富、容易獲取、體外擴(kuò)增速度快、安全實(shí)用性、無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)作為種子細(xì)胞來(lái)構(gòu)建細(xì)胞膜片，同時(shí)選擇具有良好的生物相容性、可降解性、與松質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)類似的多孔樣磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate, TCP)作為支架材料。

1材料和方法

1.1 材料：3月齡成年新西蘭大耳白兔，體重2.6～3.0kg，雌雄不限，由總醫(yī)院動(dòng)物中心提供。6周齡裸鼠(NIH strain, outbred) 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DMEM培養(yǎng)基（購(gòu)自Gibco, Invitrogen Corp）；L－谷胺酰胺、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、胰蛋白酶（均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胎牛血清(杭州四季青公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma公司3110Ⅱ，美國(guó))，倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympas IX71. A21PH, 日本)，離心機(jī)(Heraens Cryofuge 8000, 德國(guó))，一型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）。

1.2 方法

1.2.1 兔BMSCs分離、培養(yǎng)、及細(xì)胞膜片構(gòu)建：氯胺酮（10 mg/kg）肌內(nèi)注射麻醉下，切取兔雙側(cè)髂骨并劈開(kāi)，用含200 U/ml肝素的低糖DMEM沖洗髓腔、過(guò)濾骨髓、離心、棄上清、加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，接種到直徑為10cm的普通培養(yǎng)皿里。加入含100 U/ml 青霉素、10%胎牛血清、50mg/L抗壞血酸、0.27g/L L-谷胺酰胺的低糖DMEM，置于37℃、5% CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2天更換培養(yǎng)液一次。當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化后按1:3 傳代，換成含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，90%融合時(shí)再消化，按密度1×105個(gè)/cm2接種到直徑為10cm的培養(yǎng)皿。細(xì)胞融合后，更換為含10%胎牛血清，1×10-7mol/L地塞水松，50mg/L抗壞血酸，10mmol/L β-甘油磷酸鈉的高糖DMEM條件培養(yǎng)液，每隔2 天換培養(yǎng)液1次，經(jīng)2周的連續(xù)培養(yǎng)，用細(xì)胞刮刀由外周向中心沿底壁仔細(xì)刮起，獲得完整的細(xì)胞膜片[5]。

1.2.2 細(xì)胞膜片顯微結(jié)構(gòu)觀察：隨機(jī)選取所獲細(xì)胞膜片，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，切成5μm厚切片，蘇木精－伊紅染色（H&E）光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)。部分膜片樣本經(jīng)丙酮固定，鈣鈷法進(jìn)行堿性磷酸酶染色。部分膜片經(jīng)2.5% 戊二醛固定，梯度乙醇脫水，干燥，噴金，掃描電子顯微鏡觀察標(biāo)本表面形貌及層面結(jié)構(gòu)。

1.2.3 體內(nèi)試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組將單層細(xì)胞膜片剪切成10mm×25mm的長(zhǎng)方形狀（圖1A），并由一端卷起包裹預(yù)制成的TCP圓柱體（直徑0.8cm，高度1.0cm，70%孔隙率，平均孔徑450± 50μm，圖2A、B），靜置孵育24h后移植到裸鼠背部皮下。作為對(duì)照，相同大小的細(xì)胞膜片和同規(guī)格經(jīng)成骨培養(yǎng)基孵育24h的單純材料也進(jìn)行皮下移植。術(shù)后6周處死動(dòng)物取材，進(jìn)行大體觀察及組織形態(tài)學(xué)分析：①組織學(xué)定性分析：各樣本經(jīng)石蠟包埋、切片后HE及Mallory 三色染色光鏡觀察；②組織學(xué)半定量分析：每組每例樣本連續(xù)4張5μm厚切片，橫貫整個(gè)樣本，Mallory 三色染色后由獨(dú)立的觀察者采用NIH Image J圖像分析系統(tǒng)在10倍鏡下分析切片中骨樣組織（磚紅色）與纖維組織（淡藍(lán)色）所占的面積百分比。每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野，計(jì)量后收集各組數(shù)據(jù)，取其平均值。

2結(jié)果

2.1 膜片的構(gòu)建：融合BMSCs經(jīng)過(guò)2周連續(xù)培養(yǎng)，皿底有透明乳白色薄膜樣物質(zhì)形成，表面散在多個(gè)白色結(jié)節(jié)。用細(xì)胞刮沿皿底輕刮即可使其與培養(yǎng)皿底分離，刮起后膜片自行收縮，具有彈性和較穩(wěn)定的機(jī)械性能，可以用鑷子或血管鉗進(jìn)行鉗夾操作。HE染色，所獲膜片具有類似三維結(jié)構(gòu)，由約8～10層細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)組成，厚度平均158μm （圖1B）。掃描電鏡下觀察：膜片中細(xì)胞被細(xì)胞外基質(zhì)包埋，基質(zhì)表面可見(jiàn)礦化結(jié)節(jié)聚集（圖2C）。

2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 移植6周后：實(shí)驗(yàn)組和TCP組取材標(biāo)本的形狀與移植前無(wú)明顯變化，但前者表面較硬，容易與周圍軟組織分離，后者表面被覆一層質(zhì)軟的纖維組織，不易分離。膜片組見(jiàn)紙片狀硬質(zhì)組織形成。

2.2.2 組織學(xué)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組的外周表現(xiàn)為礦化程度較高的板層狀骨組織，可見(jiàn)致密骨基質(zhì)、骨陷窩、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等結(jié)構(gòu)，材料內(nèi)部的孔隙中央為纖維組織，周邊見(jiàn)低度礦化的小梁骨（圖3A、B、C）。組織定量學(xué)分析，骨與纖維組織的所占面積分別為22.5%和59.6%。單一TCP組孔隙內(nèi)為纖維組織（面積比為76.1%），未見(jiàn)骨或軟骨樣組織。單純膜片組見(jiàn)片狀編織骨形成，致密的骨基質(zhì)中可見(jiàn)類髓腔樣結(jié)構(gòu)（圖3D）。

3討論

本研究證實(shí)了BMSC膜片與多孔TCP支架材料復(fù)合構(gòu)建組織工程骨的可行性。與傳統(tǒng)方法相比，本研究應(yīng)用的構(gòu)建方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：①采用物理刮治的方法將體外擴(kuò)增的細(xì)胞連同培養(yǎng)過(guò)程中自分泌的細(xì)胞外基質(zhì)、形成的細(xì)胞基質(zhì)連接一同收集，避免了傳統(tǒng)用胰蛋白酶消化的有創(chuàng)收集方法；②具有較高的細(xì)胞利用率。

細(xì)胞膜片技術(shù)由日科學(xué)家Okano等[6]發(fā)明，他們將溫度敏感性聚合物凝膠涂層于普通培養(yǎng)皿底壁制備出了溫敏性培養(yǎng)皿，在37℃時(shí)聚合物對(duì)其表面擴(kuò)增融合的單層細(xì)胞膜片有絕對(duì)親和性，但降至其臨界溶液溫度32℃以下時(shí)，此聚合物對(duì)單層細(xì)胞膜片的親和性消失，使細(xì)胞膜片自動(dòng)從培養(yǎng)皿底壁釋放。該培養(yǎng)技術(shù)避免了對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳統(tǒng)胰蛋白酶消化等處理，進(jìn)而保留了細(xì)胞自分泌的細(xì)胞外基質(zhì)以及一些重要的細(xì)胞表面蛋白如離子通道、生長(zhǎng)因子受體、細(xì)胞-細(xì)胞連接蛋白。利用此技術(shù)，角膜、皮膚、心肌、肝組織等多種細(xì)胞密集型軟組織已被成功構(gòu)建[3]，但在用于骨組織方面的研究較少。2007年，Zhou等[4]首先報(bào)道用細(xì)胞膜片技術(shù)與復(fù)合離散細(xì)胞懸液的聚合物-陶瓷材料（磷酸三鈣-聚已酸內(nèi)酯復(fù)合物）構(gòu)建出組織工程骨；Gao等[7]則用多層細(xì)胞膜片與管狀珊瑚構(gòu)建出管型骨。Okano等獲取膜片的技術(shù)操作程序較復(fù)雜，而且應(yīng)用溫敏聚合物，可能會(huì)影響細(xì)胞的增殖分化。同時(shí)該技術(shù)獲得的膜片為單層細(xì)胞組成，厚度只有約10μm[8]。相比之下，我們的細(xì)胞膜片獲取方法簡(jiǎn)單易行，無(wú)需特殊材料或者設(shè)備，而且由多層細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)組成，厚度可達(dá)158μm，更像三維結(jié)構(gòu)的組織。另外，一定的厚度賦予了膜片相應(yīng)的彈性和較穩(wěn)定的機(jī)械性能，增加了可操作性。本研究則用單層膜片與已用于臨床的人工骨替代材料TCP復(fù)合。

有趣的是，實(shí)驗(yàn)組中，不僅在支架材料的外周有礦化程度較高的骨組織形成，而且在材料內(nèi)部也可見(jiàn)相當(dāng)數(shù)量的骨小梁。這一結(jié)果表明：作為細(xì)胞釋放載體系統(tǒng)，細(xì)胞膜片可賦予無(wú)機(jī)材料以生物活性。另一個(gè)有趣的結(jié)果是，與單純材料組相比，實(shí)驗(yàn)組材料孔隙結(jié)構(gòu)內(nèi)的纖維組織量較少，意味著細(xì)胞膜片在促進(jìn)成骨的同時(shí)阻止了纖維組織的張入，有望成為新型的具有生物活性的組織引導(dǎo)再生膜。

組織工程骨要取代自體骨移植大范圍應(yīng)用于臨床，首先需要解決大體積支架內(nèi)部細(xì)胞的氧氣、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)以及代謝產(chǎn)物排泄。種子細(xì)胞在體外依賴于培養(yǎng)介質(zhì)提供營(yíng)養(yǎng)，而植入到體內(nèi)后，如同非血管化的游離骨移植，則需依靠受區(qū)組織液的彌散滲透作用獲得營(yíng)養(yǎng)。然而，理論上體內(nèi)環(huán)境通常所能提供的最大彌散距離是150～200μm，因此大體積復(fù)合物內(nèi)相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞因?yàn)闊o(wú)法獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并排泄代謝產(chǎn)物而死亡[9-10]。盡管已有諸多方法可促進(jìn)組織工程植入物與宿主血管網(wǎng)的緊密聯(lián)系，提高細(xì)胞成活率和組織修復(fù)功能，但目前為止，任何促進(jìn)血管生長(zhǎng)的方法都需要5～7天以上時(shí)間才能使植入細(xì)胞獲得血液供應(yīng)，在這段時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞需從組織液中獲得足夠營(yíng)養(yǎng)[10]。本實(shí)驗(yàn)所應(yīng)用的BMSC膜片厚度為 158μm左右，在有效組織彌散范圍內(nèi)。我們推測(cè)將其植入體內(nèi)后易于成活，有利于提高細(xì)胞治療的效率。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Meijer GJ,de Bruijn JD,Koole R,et al. Cell-based bone tissue engineering[J]. PLoS Med,2007,4(2):e9.

[2]Quarto R,Mastrogiacomo M,Cancedda R,et al. Repair of large bone defects with the use of autologous bone marrow stromal cells[J].N Engl J Med,2001,344(5):385-386.

[3]Yang J,Yamato M, Shimizu T, et al. Reconstruction of functional tissues with cell sheet engineering[J]. Biomaterials,2007,28(34):5033-5043.

[4]Zhou Y,Chen F,Ho ST,et al. Combined marrow stromal cell-sheet techniques and high-strength biodegradable composite scaffolds for engineered functional bone grafts[J]. Biomaterials,2007,28(5):814-824.

[5]Ma D,Ren L,Liu Y,et al. Engineering scaffold-free bone tissue using bone marrow strom cell sheets[J].J Orthop Res,2010,28(5):697-702.

[6]Okano T,Yamada N,Sakai H,et al. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide)[J].J Biomed Mater Res,1993,27(10):1243-1251.

[7]Gao Z,Chen F,Zhang J,et al. Vitalisation of tubular coral scaffolds with cell sheets for regeneration of long bones: a preliminary study in nude mice[J].Br J Oral Maxillofac Surg,2009,47:116-122.

[8]Iwata T,Yamato M,Tsuchioka H,et al. Periodontal regeneration with multi-layered periodontal ligament-derived cell sheets in a canine model[J].Biomaterials,2009,14:2716-2723.

[9]Ren LL,Ma DY,Feng X,et al. A novel strategy for prefabrication of large and axially vascularized tissue engineered bone by using an arteriovenous loop[J].Med Hypotheses,2008,71(5):737-740.

篇8

[關(guān)鍵詞] 重組粒細(xì)胞集落刺激因子；再生障礙性貧血；感染；免疫功能

[中圖分類號(hào)] R556 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）09（b）-0060-04

[Abstract] Objective To explore the effects of recombinant human granulocyte colony stimulating factor （rhG-CSF） on immune function in patients with aplastic anemia （AA） complicted with infection. Methods The data of 140 cases of patients with AA complicted with infection in Hainan Provincial People's Hospital from January 2011 to June 2014 were retrospective analyzed. There were 72 patients treated with rhG-CSF combined with Cyclopsorin， taken as the experimetal group； and the other 68 cases of patients only treated with Cyclopsorin were taken as the control group. The therapeutic effect， mortality related to infection， rates of clonal evolution and changes of peripheral blood cells and T cell subsets levels of the two groups after treatment were compared. Results The total effective rate of the experimetal group wa significantly higher than that of the control group （P < 0.05）. The mortality related to infection of the experimetal group was lower and the rate of clonal evolution was higher than those of the control group， but there were no significant differences between the two groups （P > 0.05）. In the experimetal group， after treatment the WBC， PLT， Hb levles increased， CD3+and CD4+ levels decreased and CD8+ level increased than those of before treatment， with statistically significant differences （P < 0.05）； while those indexes of the experimetal group were all significantly improved than the control group （P < 0.05）. Conclusion The treatment effect of rhG-CSF in patients with AA complicted with infection is remarkable， with low infection rate， which can promote the recovery of immune function， safe and reliable， and it is worthy of clinical reference.

[Key words] Recombinant human granulocyte colony stimulating factor； Aplastic anemia； Infection； Immune function

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是血液系統(tǒng)較為常見(jiàn)的惡性疾病，多見(jiàn)于兒童群體，主要是由于多種因素引起的骨髓造血功能障礙，其特征為外周血全血細(xì)胞減少，故AA多合并感染的發(fā)生，會(huì)進(jìn)一步對(duì)造血功能產(chǎn)生較大損害[1]。主要臨床表現(xiàn)為貧血、感染、出血、發(fā)熱等，若不及時(shí)治療，對(duì)患者健康造成嚴(yán)重影響，甚至危及其生命。因此，采取合理有效的治療措施，以防治感染、促進(jìn)造血功能恢復(fù)顯得尤為重要。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF）是機(jī)體的造血因子之一，對(duì)增強(qiáng)中性細(xì)胞功能及促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖具有重要作用[2-3]。為探討rhG-CSF對(duì)AA并感染患者免疫功能的影響，本研究將海南省人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）收治的AA并感染患者140例作為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行rhG-CSF治療，取得滿意效果，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性調(diào)查分析2011年1月～2014年6月我院收治的140例再生障礙性貧血并感染患者資料。入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合《內(nèi)科學(xué)》中關(guān)于AA的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；②由臨床癥狀、病理檢查等確診；③無(wú)精神疾病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①對(duì)免疫抑制劑或激素過(guò)敏者；②合并有高血壓、糖尿病等其他非感染性疾病者；③有嚴(yán)重肝腎功能障礙者；④妊娠及哺乳期婦女。將140例患者按治療方式分為實(shí)驗(yàn)組（72例）和對(duì)照組（68例），實(shí)驗(yàn)組男43例，女29例；年齡23～49歲，平均（32.6±7.8）歲；上呼吸道感染19例，肺部感染14例，口腔黏膜感染13例，胃腸道感染12例，敗血癥14例。對(duì)照組男41例，女27例；年齡21～46歲，平均（31.8±7.6）歲；上呼吸道感染17例，肺部感染12例，口腔黏膜感染13例，胃腸道感染11例，敗血癥15例。兩組性別、年齡、感染情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2治療方法

兩組患者均采用營(yíng)養(yǎng)支持、抗感染等常規(guī)對(duì)癥治療。對(duì)照組采用環(huán)孢霉素（天津市中央藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：20093879）治療，5 mg/kg，2次/d，維持血藥濃度為150～300 mg/mL，持續(xù)外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)升高達(dá)平臺(tái)期后逐漸減量；潑尼松龍片（上海信誼藥廠有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：20150906）每天1 mg/mL，連續(xù)治療15 d后逐漸減量，至1個(gè)月后停用。實(shí)驗(yàn)組采用刺激因子聯(lián)合環(huán)孢霉素治療，給予rhG-CSF5（上海三維生物技術(shù)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：20150629），每天5 μg/kg，同時(shí)服用環(huán)孢霉素，5 mg/kg，2次/d，連續(xù)治療3個(gè)月。

1.3 觀察指標(biāo)和判斷標(biāo)準(zhǔn)

外周血象及T細(xì)胞亞群變化分別于治療前和治療后3個(gè)月進(jìn)行檢測(cè)，血常規(guī)檢查采集2 mL靜脈血，用EDTA管抗凝，T細(xì)胞亞群檢查采用流式細(xì)胞儀。

比較兩組感染相關(guān)死亡率、克隆性演變發(fā)生率，其中，克隆性演變包括骨髓增生異常綜合征、夜間陣發(fā)性血紅蛋白尿及急性髓系白血病等。

臨床療效根據(jù)1987年第四屆全國(guó)再障學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的《再生障礙性貧血診斷標(biāo)準(zhǔn)與療效標(biāo)準(zhǔn)》[5]?；局斡贺氀?、出血等臨床癥狀完全消失，白細(xì)胞（WBC）水平達(dá)到4×109/L左右，血小板（PLT）達(dá)80×109/L，隨訪1年以上沒(méi)有復(fù)發(fā)者；②顯效：臨床癥狀顯著改善，PLT比治療前有明顯增加，WBC達(dá)3.5×109/L，隨訪3個(gè)月病情穩(wěn)定或繼續(xù)進(jìn)步者；③有效：出血及貧血癥狀明顯好轉(zhuǎn)且基本穩(wěn)定，在不輸血情況下血紅蛋白（Hb）較治療前1個(gè)月增長(zhǎng)30 g/L以上，并維持3個(gè)月不變；④無(wú)效：臨床癥狀未見(jiàn)明顯好轉(zhuǎn)或加重?？傆行?基本治愈+顯效+有效。兩組均在治療1年后評(píng)定療效。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組治療1年后臨床療效比較

實(shí)驗(yàn)組總有效率為95.83%，對(duì)照組總有效率為76.47%，實(shí)驗(yàn)組明顯優(yōu)于對(duì)照組（P < 0.05）。

2.2 兩組感染相關(guān)死亡率比較

治療后實(shí)驗(yàn)組感染相關(guān)死亡率為4.17%，對(duì)照組感染相關(guān)死亡率為14.71%，實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組，但兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.3 兩組克隆性演變發(fā)生率比較

治療后實(shí)驗(yàn)組克隆性演變發(fā)生率為9.72%，對(duì)照組克隆性演變發(fā)生率為2.94%，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，但兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.4 兩組外周血象及T細(xì)胞亞群變化比較

治療前兩組外周血WBC、PLT、Hb及T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；治療后兩組WBC、PLT、Hb較治療前升高，T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+較治療前下降，而CD8+較治療前顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；實(shí)驗(yàn)組治療后WBC、PLT、Hb、CD8+水平明顯高于對(duì)照組，CD3+、CD4+明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表4。

3 討論

AA是惡性血液疾病常見(jiàn)的類型之一，AA的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，主要與以下三點(diǎn)有關(guān)：①“種子”學(xué)說(shuō)[6]，即骨骼中造血干細(xì)胞缺陷；②“土壤”學(xué)說(shuō)[7]，即骨髓造血微環(huán)境出現(xiàn)異常；③“蟲(chóng)子”學(xué)說(shuō)[8]，即機(jī)體的免疫功能異常。其中，免疫功能異常被臨床認(rèn)為是AA主要的發(fā)病機(jī)制，因此，目前臨床多采用免疫抑制療法（immuno suppressive therapy，IST）和造血干細(xì)胞移植（hema-topoietic stem cell transplantation，HSCT）作為最佳的治療方法，但由于HSCT費(fèi)用較高及來(lái)源困難等，使得IST成為臨床主要的治療手段[9-10]。

抗胸腺球蛋白主要是通過(guò)T淋巴細(xì)胞促進(jìn)造血干細(xì)胞生長(zhǎng)，增強(qiáng)造血生長(zhǎng)因子的敏感性[11]。環(huán)孢霉素A屬免疫抑制劑，主要通過(guò)抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，從而降低γ干擾素（IFN-）及白介素-2（IL-2）的產(chǎn)生[12]。采用rhG-CSF聯(lián)合環(huán)孢霉素治療，較單一采用環(huán)孢霉素治療效果更為顯著，可加強(qiáng)T淋巴細(xì)胞毒性，最大程度提高藥物療效，對(duì)AA的臨床治療效果具有極為重要的作用[13]。但是由于AA患者具有中性粒細(xì)胞缺乏的特點(diǎn)，因而機(jī)體自身抵抗力低下，極易發(fā)生感染[14]。因此，感染發(fā)生后，應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)及時(shí)控制感染，以促進(jìn)造血功能恢復(fù)，是AA治療的關(guān)鍵。

rhG-CSF是一種造血生長(zhǎng)因子，能有效促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖、分化及成熟，從而促進(jìn)骨髓造血功能恢復(fù)[15-16]。本研究顯示，rhG-CSF具有以下幾點(diǎn)作用機(jī)制：①促進(jìn)中性粒細(xì)胞釋放花生四烯酸及白細(xì)胞堿性磷酸酶，從而產(chǎn)生中性粒細(xì)胞超氧陰離子；②刺激中性粒細(xì)胞增殖和分化，從而增強(qiáng)成熟粒細(xì)胞吞噬作用；③增加白細(xì)胞數(shù)量的同時(shí)，增加白細(xì)胞的黏附性，發(fā)揮抗感染作用。故rhG-CSF對(duì)AA并感染患者的治療具有極為重要的意義[17]。相關(guān)研究認(rèn)為，將rhG-CSF應(yīng)用于AA合并感染患者治療中不僅效果顯著，同時(shí)安全性和可行性也較好[18-19]。

本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組總有效率明顯高于對(duì)照組，表明rhG-CSF聯(lián)合免疫抑制法較單一采用免疫抑制法治療效果顯著。實(shí)驗(yàn)組感染相關(guān)死亡率低于對(duì)照組，但兩組比較無(wú)顯著差異（P > 0.05），這可能與樣本量較小有關(guān)。rhG-CSF具有一定的不良反應(yīng)，本研究顯示，實(shí)驗(yàn)組克隆演變發(fā)生率高于對(duì)照組，兩組比較無(wú)顯著差異（P > 0.05），說(shuō)明本研究結(jié)果不支持rhG-CSF與免疫抑制法聯(lián)用時(shí)增加克隆性疾病發(fā)生率的觀點(diǎn)。另外在本研究中，治療后，實(shí)驗(yàn)組外周血象WBC、PLT、Hb升高幅度優(yōu)于對(duì)照組，且T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+改善幅度優(yōu)于對(duì)照組，與相關(guān)研究結(jié)果一致[20-21]。進(jìn)一步表明，rhG-CSF聯(lián)合環(huán)孢霉素較單獨(dú)采用環(huán)孢霉素治療效果更為顯著，更能有效提高AA并感染患者的免疫力，這可能與rhG-CSF加快造血功能恢復(fù)有關(guān)。

綜上所述，采用免疫抑制法聯(lián)合rhG-CSF對(duì)AA并感染患者進(jìn)行治療，能有效提高治療效果，降低感染導(dǎo)致死亡的發(fā)生率，且克隆性疾病的發(fā)生率增高不明顯，從而促進(jìn)免疫功能恢復(fù)，對(duì)臨床進(jìn)一步推廣使用具有一定價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 劉曉明，鄒堯，王書(shū)春，等.強(qiáng)化免疫抑制治療聯(lián)合不同方案重組粒細(xì)胞集落刺激因子治療兒童重型再生障礙性貧血的臨床研究[J].中華兒科雜志，2014，52（2）：84-89.

[2] 梁彩平，劉俏敏，鐘燕玲.重組粒細(xì)胞集落刺激因子在再生障礙性貧血中的應(yīng)用[J].中國(guó)臨床研究，2015，28（4）：439-441.

[3] Sivgin S，Karakus E，Keklik M，et al. Evaluation of the efficacy and safety of original filgrastim（NeupogenR），biosimilar filgrastim（LeucostimR）and Lenograstim（GranocyteR）in CD34（+）peripheral hematopoietic stem cell mobilization procedures for allogeneic hematopoietic stem cell transplant donors [J]. Transfus Apher Sci，2016，54（3）：410-415.

[4] 葛均波，徐永健.內(nèi)科學(xué)[M].北京人民衛(wèi)生出版社，2013：

[5] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì)紅細(xì)胞疾?。ㄘ氀W(xué)組.再生障礙性貧血診斷治療專家共識(shí)[J].中華血液學(xué)雜志，2010， 31（11）：790-792.

[6] Sasaki K，Popat U，Jain P，et al. Successful treatment of aplastic anemia-paroxysmal nocturnal hemoglobinuria associated with eosinophilic fasciitis with matched unrelated donor allogeneic peripheral blood stem cell transplantation [J]. Clinical Case Reports，2016，4（8）：765-767.

[7] 徐黎，張倩喬，張征，等.再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征及急性髓系白血病患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1及其受體CXCR4的表達(dá)水平和意義[J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐，2010，9（5）：498-502.

[8] 唐文玨.免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞在再生障礙性貧血細(xì)胞免疫功能紊亂中的作用[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2015，21（16）：87-88.

[9] 劉英，唐鎖勤，黃文榮，等.單倍體造血干細(xì)胞移植治療兒童重型再生障礙性貧血[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2013， 21（4）：985-989.

[10] 左書(shū)凝，許蘭平.單倍體相合造血干細(xì)胞移植治療重型再生障礙性貧血的現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].中華血液學(xué)雜志，2015，36（8）：707-710.

[11] 吳新華，王立偉，袁丞達(dá).抗胸腺細(xì)胞球蛋白聯(lián)合環(huán)孢素治療重型再生障礙性貧血的療效觀察[J].中國(guó)基層醫(yī)藥，2016，23（1）：71-73.

[12] Shetty M，Narendra AM，Adiraju KP，et al. Study of aplastic anaemia with cyclosporine in resource poor setting [J]. J Clin Diagn Res，2016，10（6）：OC15-18.

[13] Ankit P，Harsha P，Asha A，et al. Acquired severe aplastic anemia treated with antithymocyte globulin and cyclos-porine： An experience of regional cancer center，Western India [J]. Journal of Applied Hematology，2015，6（2）：53-57.

[14] 田衛(wèi)平，張琳.再生障礙性貧血患者的T淋巴細(xì)胞亞群與病毒感染關(guān)系的探究[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2012，19（20）：24-25.

[15] Kononova NV，Yakovlev AV，Zhuravko AM，et al. Recombinant granulocyte colony stimulating factor（filgrastim）of prolonged action： Optimization of conditions for extraction and purification from inclusion bodies [J]. Russian Journal of Bioorganic Chemistry，2014，40（5）：507-515.

[16] Baertling F，Meissner T，Troeger A，et al. Granulocyte colony stimulating factor for treatment of neutropenia-associated infection in Pearson syndrome [J]. Klinische Pdiatrie，2014，226（3）：190-191.

[17] 陸亞嵐，高清平.造血生長(zhǎng)因子治療成人再生障礙性貧血伴嚴(yán)重感染的療效觀察[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014， 13（18）：1529-1531.

[18] 蔡洪，李捷萌，李毅俊.促紅細(xì)胞生成素治療腫瘤相關(guān)性貧血臨床效果研究[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2015，5（21）：113-115.

[19] 王莉，孫立榮.rhG-CSF對(duì)兒童慢性再生障礙性貧血促造血及抗感染作用[J].齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2011，26（4）：333-335.

[20] 鐘青，許業(yè)棟.骨髓形態(tài)檢驗(yàn)在難治性貧血與巨幼細(xì)胞性貧血鑒別診斷中的臨床價(jià)值[J]. 中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2016， 6（7）：172-174.

篇9

寒假學(xué)習(xí)計(jì)劃內(nèi)容

一、閱讀計(jì)劃

一個(gè)寒假有30天，那么30天讀2-3本書(shū)就可以了。當(dāng)然，也可以選擇讀一個(gè)系列的書(shū)。

讀書(shū)筆記和讀后感是一個(gè)方面，另一方面，可以把讀過(guò)的書(shū)籍做一個(gè)總結(jié)，以思維導(dǎo)圖或者畫(huà)報(bào)的形式呈現(xiàn)出來(lái)。

二、復(fù)習(xí)計(jì)劃

每科都是滿分的忽略此條。

期末考試了，為什么還要復(fù)習(xí)?

期末考試，是一次總結(jié)性的考試。不少學(xué)?？纪暝囍螅€要校對(duì)試卷才能放寒假。不過(guò)，大部分的學(xué)校并沒(méi)有這樣做。

通過(guò)考試，能夠發(fā)現(xiàn)孩子知識(shí)掌握得不牢固的地方。如果期末考試考得不太好，那寒假的時(shí)候，就很有必要對(duì)薄弱的地方進(jìn)行鞏固和提高。

一二三年級(jí)的內(nèi)容，我們更新得比較全面了。

只要找到不會(huì)的點(diǎn)，回去看看視頻，做做對(duì)應(yīng)的練習(xí)就可以了。

三、預(yù)習(xí)計(jì)劃

一二年級(jí)的語(yǔ)文數(shù)學(xué)視頻和一課一練都已經(jīng)更新完了，如果孩子的基礎(chǔ)比較扎實(shí)，完全可以自學(xué)。

在預(yù)習(xí)的時(shí)候，語(yǔ)文以生字的學(xué)習(xí)為主，包括生字的讀音、字形、部首、筆畫(huà)數(shù)、組詞、造句。三年級(jí)的還要自己查字典，分不同的字義組詞，再造句。

除此之外，還可以先背誦古詩(shī)。

寒假的時(shí)候，我們還會(huì)同時(shí)更新三年級(jí)的語(yǔ)文數(shù)學(xué)同步學(xué)習(xí)視頻。

四、寫(xiě)作

一年級(jí)的小朋友，下學(xué)期就要正式開(kāi)始學(xué)習(xí)看圖寫(xiě)話了。那么，在寒假的時(shí)候，先接觸一下，到時(shí)候就不會(huì)說(shuō)跟不上教學(xué)進(jìn)度。

二年級(jí)的小朋友，看圖寫(xiě)話不能滿足于寫(xiě)2-3句話。需要學(xué)習(xí)一些寫(xiě)作的方法，把內(nèi)容寫(xiě)得更加充實(shí)。

我們陸續(xù)更新了不少看圖寫(xiě)話，有需要的家長(zhǎng)可以打印出來(lái)給孩子練習(xí)。

三年級(jí)的小朋友，我們建議一周寫(xiě)2-3篇日記，可以把春節(jié)里的習(xí)俗都寫(xiě)下來(lái)。

學(xué)習(xí)計(jì)劃實(shí)施方式：

合理制定大目標(biāo)和小目標(biāo)

學(xué)習(xí)規(guī)劃首先要制定學(xué)習(xí)目標(biāo)，大目標(biāo)是整個(gè)學(xué)期所要達(dá)到的成果，小目標(biāo)可以具體到一周，每個(gè)周末回顧一下本周的學(xué)習(xí)規(guī)劃是否完成，再定下新的目標(biāo)。一個(gè)看得見(jiàn)的目標(biāo)能給孩子提供源源不斷的動(dòng)力。另外，家長(zhǎng)不要拿自己的孩子和別人家的孩子比較，如果真的要比較，就拿本周的孩子和上一周的孩子作比較吧。

篇10

一、活動(dòng)目的：

1、中秋節(jié)是中國(guó)的傳統(tǒng)節(jié)日，通過(guò)中秋節(jié)讓學(xué)生初步理解中國(guó)傳統(tǒng)節(jié)日中所蘊(yùn)涵的文化內(nèi)核，真正了解節(jié)日，了解中國(guó)傳統(tǒng)文化，幫助青少年增強(qiáng)科學(xué)節(jié)日文化理念，弘揚(yáng)創(chuàng)新節(jié)日文化。

2、介紹中秋節(jié)的來(lái)歷，了解中國(guó)各地過(guò)中秋的風(fēng)俗。

3、增強(qiáng)學(xué)生愛(ài)父母愛(ài)家鄉(xiāng)愛(ài)祖國(guó)的感情，讓節(jié)日真正給我們帶來(lái)快樂(lè)與幸福。

二、活動(dòng)時(shí)間：2012年9月25日

三、活動(dòng)準(zhǔn)備：蘇軾的《水調(diào)歌頭》ok帶、中秋燈謎、圖畫(huà)、月餅

四、活動(dòng)地點(diǎn)：八(7)班教室

五、活動(dòng)過(guò)程：

老師導(dǎo)入：中秋節(jié)，是中國(guó)的傳統(tǒng)節(jié)日。從去年開(kāi)始，國(guó)家把這個(gè)節(jié)日定為法定節(jié)日，休息一天。從而可以看出，中國(guó)逐漸對(duì)傳統(tǒng)文化和民俗越來(lái)越重視。今天我們一起來(lái)走進(jìn)中秋佳節(jié)，一起來(lái)感受中秋佳節(jié)。

一 、中秋節(jié)的來(lái)歷和風(fēng)俗

1、 中秋節(jié)的由來(lái)

(1)老師：同學(xué)們，每當(dāng)天氣晴朗的夜晚，天空上有什么?月亮像什么?(有月亮。月亮像玉盤(pán)、像圓餅。)

(2)、出示圓形月餅，讓學(xué)生比較。

老師：月亮在最圓的時(shí)候是什么日子?(每個(gè)月的十五日左右。)

(3)、說(shuō)中秋節(jié)的由來(lái)。

老師：誰(shuí)知道中秋節(jié)的來(lái)歷?

(4)、小結(jié)：同學(xué)們都說(shuō)得很好，八月十五中秋節(jié)的時(shí)候月亮圓滿，象征團(tuán)圓，所以也叫團(tuán)圓節(jié)。它起源于魏晉時(shí)期，在唐朝初年成為我們國(guó)家固定的節(jié)日，這也是我國(guó)僅次于春節(jié)的第二傳統(tǒng)節(jié)日。中秋的另一個(gè)說(shuō)法是：農(nóng)歷八月十五這一天剛好是稻子成熟的時(shí)刻，每家都拜土地神，中秋可能是秋報(bào)的遺俗。

2、中秋節(jié)的傳說(shuō)與民間故事

(1)老師引：中秋節(jié)在我們中國(guó)人眼里，可是非常重要的佳節(jié)。“月圓人團(tuán)圓”，

那是一個(gè)溫馨和諧、及富詩(shī)情畫(huà)意的節(jié)日。中秋節(jié)最有名的傳說(shuō)故事就是嫦娥奔月了

老師：有誰(shuí)能來(lái)講講有關(guān)中秋節(jié)的傳說(shuō)，中秋節(jié)的起源及一些民間故事? 生：嫦娥奔月(后羿射日)：

(2)指名講述嫦娥奔月的故事。

(3)引導(dǎo)學(xué)生講述不同版本的傳說(shuō)，吳剛伐桂;玉兔搗藥等等。

老師(小結(jié))：看來(lái)中秋節(jié)是最有人情味、最詩(shī)情畫(huà)意的一個(gè)節(jié)日。

3、學(xué)生介紹中秋節(jié)的習(xí)俗

老師引：好，聽(tīng)了我給你們講的故事，你們一定意猶未盡吧。現(xiàn)在我們請(qǐng)嫦娥姑娘來(lái)給我們介紹中秋節(jié)有趣的傳統(tǒng)習(xí)俗。(《拜月娘》、《拜土地公》)

二、中秋詩(shī)詞佳句知多少

老師：有人說(shuō)，每逢佳節(jié)倍思親，團(tuán)圓節(jié)這份思念當(dāng)然會(huì)更密切，尤其是一輪明月高高掛的時(shí)期，詩(shī)人就會(huì)用詩(shī)詞來(lái)表達(dá)對(duì)家鄉(xiāng)、親人的思念。

(1)、出示圖片1

老師問(wèn)： 我們來(lái)看這幅畫(huà)，同學(xué)們腦中有沒(méi)有最佳的詩(shī)句來(lái)配這幅畫(huà)中的情景。 ——(李白的《靜夜思》)

學(xué)生齊背《靜夜思》。

(2)、老師：中國(guó)畫(huà)詩(shī)書(shū)畫(huà)印融為一體，這幅中國(guó)畫(huà)書(shū)畫(huà)印都有，惟獨(dú)缺詩(shī)，我們給它題首詩(shī)，使它變得更完整。

(學(xué)生發(fā)言)(舉杯邀明月，對(duì)影成三人。選自李白《月下獨(dú)酌》)(你們知道 “但愿人長(zhǎng)久，千里共嬋娟” 這句話出自誰(shuí)人之口嗎?

(3)對(duì)了，幾百年前丙辰中秋的一個(gè)夜晚，正是大文豪東坡先生寫(xiě)下了著名的中秋詞《水調(diào)歌頭?明月幾時(shí)有》，“但愿人長(zhǎng)久，千里共嬋娟”就出自這首詞。老師：今天，我們就一起來(lái)欣賞這首絕妙好詞。

(4)有感情朗讀：蘇軾的《水調(diào)歌頭》，劉禹錫的《八月十五夜桃源玩月》

(5)學(xué)唱蘇軾的《水調(diào)歌頭》

我國(guó)的詩(shī)人大多是憂國(guó)憂民的，又大多是命運(yùn)坎坷的，他們經(jīng)常流浪在外，客居他鄉(xiāng)，思鄉(xiāng)成了他們生活中重要的一部分，因此有了許多以思念故鄉(xiāng)為題材的詩(shī)作，你還知道哪些呢?

(6)指名背誦《泊船瓜洲》、《九月九日憶山東兄弟》等。

三、 中秋佳節(jié)話月餅

1、品嘗月餅，感受月餅的香甜。

老師：學(xué)生們每年是怎樣過(guò)中秋的呢?(隊(duì)員講出各種賀中秋的民俗活動(dòng))

(1) 引出——吃月餅、送月餅

月餅的外形——圓，象征團(tuán)圓，表達(dá)合家團(tuán)圓。

餅中有餡，表面有花紋，花紋主要有月亮、桂樹(shù)、玉兔等在圓中表達(dá)美好的愿望。現(xiàn)代的花紋設(shè)計(jì)更是各異，別致。(欣賞月餅圖片若干張)

老師：展示月餅事物，并簡(jiǎn)單介紹圓形設(shè)計(jì)的格式。(對(duì)稱、均衡)

(2) 動(dòng)動(dòng)手，設(shè)計(jì)一個(gè)別致、精美的月餅圖案。(背景播放輕快的音樂(lè))

(3)學(xué)生作品欣賞。由學(xué)生講解自己的設(shè)計(jì)意圖。

2、舉辦月餅宴

老師：中秋節(jié)，為什么要和家人一起吃月餅?往年你和誰(shuí)一起吃月餅?(吃月餅表示團(tuán)圓;和家里人一起吃;還和好朋友一起吃。)

師：你吃的月餅是買(mǎi)的呢，還是別人送的?誰(shuí)送的?

老師：為什么要送月餅?(過(guò)團(tuán)圓節(jié)，送月餅表示和家人團(tuán)圓。)咱們班級(jí)也是一個(gè)大家庭，我們都是這個(gè)家庭的成員，你們?cè)覆辉敢夂腿w同學(xué)一起過(guò)這個(gè)中秋節(jié)?(板書(shū)課題)

① 送月餅：

② 吃月餅(大家一起吃月餅，體驗(yàn)班級(jí)大家庭的溫暖和團(tuán)圓)

四、中秋燈謎

1、老師：在許多地方八月十五這天會(huì)有燈會(huì)，其中一項(xiàng)就是猜燈謎。得月樓前先得月。猜一字(棚)

2、重逢。猜一字(觀)

3、舉杯詢包拯。打一句宋詞(把酒問(wèn)青天)

4、十五的月亮。打一成語(yǔ)(正大光明)

五、游戲：“月”字組詞接龍。

要求：以“月”字開(kāi)頭組詞，以“中秋節(jié)”收尾。

優(yōu)勝：組詞過(guò)程短者獲勝。 六、老師總結(jié)

同學(xué)們了解了那么多關(guān)于中秋節(jié)的知識(shí)，又為過(guò)今年的中秋節(jié)出了那么多好主