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【摘要目的摘要：觀察左旋卡尼汀對心肌缺血/再灌注（MI/R）后心肌細胞凋亡的影響，探索其保護功能的機制.方法摘要：制備家兔MI/R模型，缺血45min，再灌注3h.25只家兔隨機分為三組摘要：對照組（Ⅰ組，n=5），MI/R組(Ⅱ組，n=10),左旋卡尼汀治療組（Ⅲ組，n=10）在缺血后5min靜脈注射左旋卡尼?。?.5mL/（kg%26#12539;h）］.再灌注結束后檢測心肌組織SOD活性，原位末端標記(TUNEL)法測定凋亡心肌細胞，免疫組化法測定凋亡相關基因bcl2,fas的表達.結果摘要：MI/R造成明顯的心臟功能障礙，缺血區(qū)細胞凋亡.SOD活性明顯升高，凋亡指數（AI）和Fas含量減少（P%26lt;0.05）,Bcl2含量明顯升高（P%26lt;0.05）.結論摘要：左旋卡尼汀具有抗缺血再灌注后心肌損傷的功能，其機制可能是通過調節(jié)Bcl2和Fas介導的細胞凋亡而實現.

【左旋卡尼汀；再灌注損傷；心肌缺血；細胞凋亡

0引言

缺血/再灌注（myocardialischemia/reperfusion，MI/R）損傷是冠狀動脈再通后一個重要的并發(fā)癥，也是致死原因之一.有學者提出，細胞凋亡可能為再灌注損傷發(fā)病機制中的一個重要環(huán)節(jié)［1］；通過干預凋亡基因的表達以阻斷細胞凋亡過程，從而減輕再灌注損傷能否成為防治再灌注損傷的有效方法已受關注.卡尼汀，又名肉毒堿，可加速脂肪的β氧化，提高三磷酸腺苷（ATP）水平，優(yōu)化心肌能量代謝途徑.近期的大規(guī)模臨床試驗CEMID的結果提示［2］，左旋卡尼汀明顯改善心肌梗死后患者的心功能，降低死亡率，縮小梗死面積.卡尼汀探究的新發(fā)現［3］，提示卡尼汀在對缺血性心臟病的功能中，優(yōu)化心肌能量代謝，抑制MI/R心肌細胞凋亡可能是保護缺血再灌注心肌的重要機制.我們通過MI/R模型，探索左旋卡尼汀對MI/R心肌細胞的保護功能及其可能的機制.

1材料和方法

1．1材料

健康家兔25只，雌雄不限，體質量2.5～3.0kg（第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供）.卡尼?。ǔＶ萑还I(yè)技術探究所研制）；InSituCellDeathDetectionPOD試劑盒德國寶麗曼公司產品；Fas和Bcl2mAb，免疫組化試劑盒（購自北京中山生物有限公司）；伊文蘭和氯化三苯基四氮唑（TTC）購自Sigma公司.

1.2方法

1.2.1MI/R模型的制備30g/L戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔麻醉，頸部居中切開.分離左側頸靜脈插管連接輸液泵.同步記錄心電圖觀察ST變化.心肌MI/R模型參照simpsond的方法加以改進，開胸，暴露心臟,于冠脈左室支中1/2處穿線環(huán)繞之,結扎線向外收緊，造成急性心肌缺血，45min后放松結扎線使冠狀動脈再通形成再灌注.各組中用以心肌梗死范圍和細胞凋亡檢測的心臟各半.

1.2.2分組隨機分為三組摘要:Ⅰ組空白對照組（n=5）,絲線穿過冠狀動脈左室支但不結扎；Ⅱ組MI/R組（n=10），MI后5min注射生理鹽水，至實驗結束.Ⅲ組左旋卡尼汀治療組（n=10），MI后5min注射左旋卡尼汀1.5mL/(kg%26#12539;h).

1.2.3測定SOD含量實驗結束后即刻分別取缺血區(qū)及正常供血區(qū)左心室心肌組織1.0g，低溫狀態(tài)下生理鹽水沖洗干凈，制成心肌勻漿液，離心后取上清液，按試劑盒說明書操作.

1.2.4細胞凋亡檢測及計算凋亡率再灌注3h結束后，分離左心室心肌，取缺血區(qū)心肌組織，用100g/L甲醛液固定24h，常規(guī)脫水,石蠟包埋，切片，采用末端標記TUNEL法檢測心肌細胞凋亡.按照試劑盒說明書操作.每一心臟取3張切片，在高倍鏡下（10目鏡×40物鏡）檢測，于凋亡陽性細胞區(qū)域隨機選擇10個視野，對凋亡陽性細胞計數并行計算機圖像分析，作半定量測定，以心肌凋亡陽性細胞數占總心肌細胞數的百分比作為心肌細胞凋亡指數（apoptoticindex，AI）.

1.2.5凋亡相關基因蛋白的檢測石蠟包埋組織連續(xù)切片，用免疫組化SP法觀察心肌細胞Fas,Bcl2的表達情況，用HPIAS1000圖像分析系統(tǒng)計算A值作為半定量參數，測量Fas,Bcl2蛋白表達.

統(tǒng)計學處理摘要：實驗數據用x±s表示，使用SPSS11.0軟件，多組比較進行onewayANOVA及LSDt檢驗，P%26lt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2結果

2．1SOD含量（kat/g)變化和I組（0.84±0.42）比較，II組（0.36±0.30）SOD活性明顯降低（P%26lt;0.05）,III組（0.72±0.30）SOD活性較II組顯著增加（P%26lt;0.05）.

2．2心肌細胞AI變化II組的AI明顯高于I組（P%26lt;0.01），III組AI明顯低于II組（P%26lt;0.01），但仍高于I組（P%26lt;0.01，表1).

2.3Fas,Bcl2蛋白含量的變化II組Fas含量明顯高于I組（P%26lt;0.01），III組Fas含量明顯低于II組（P%26lt;0.01）,和I組比較無統(tǒng)計學差異（P%26gt;0.05）.II組Bcl2含量顯著低于I組（P%26lt;0.01）和III組（P%26lt;0.01），III組Bcl2含量和I組比較無統(tǒng)計學差異（P%26gt;0.05,表1).表1各組間兔MI/R心肌凋亡指數及Bcl2,Fas含量的比較(略)

3討論

引起再灌注損傷的主要因素，目前認為和Ca2+超載［3］、氧自由基［4］和白細胞聚積有關.此外，已有多項探究報道顯示，氧自由基通過啟動Bcl2［5］，TNFα［6］多種細胞凋亡相關因素，誘導細胞發(fā)生凋亡.

細胞凋亡是指一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，通過啟動內部機制，主要是通過內源性DAN內切酶的激活，導致細胞主動死亡的過程.通過對調控細胞凋亡基因的探究，可以將細胞凋亡相關基因分為誘導基因（死亡基因）和抑制基因（生存基因）.通常在生理條件下，細胞有序而協調的激活凋亡誘導基因（fas,p53等）和/或凋亡抑制基因（bcl2等）共同控制著細胞代謝功能而維持細胞內外環(huán)境的動態(tài)變化.探究發(fā)現摘要：bcl2基因的功能主要是抑制細胞凋亡促進細胞生存.其抗凋亡的機制主要有摘要：Bcl2通過抑制自由基的產生而抑制細胞死亡,Bcl2和Bax結合成雜二聚體，可抑制Bak的促凋亡功能,Bcl2的過度表達有效地阻斷細胞色素c由線粒體向細胞質的釋放，對線粒體起始的caspase激活機制起著阻礙功能，從而抑制細胞凋亡.Fas又稱Apo1即CD95分子，是I型膜蛋白，屬腫瘤壞死因子受體家族成員.Fas和活化細胞交聯區(qū)誘導凋亡的機制主要是通過Fas和FasL結合，誘導神經鞘磷脂酶（SMase）的活化，分解SM生成神經酰氨

（Ceramide,CM）,CM通過膜結合性的絲/蘇氨酸激酶等激活第二信使，使胞內Ca2+濃度升高，引發(fā)一系列的生化反應，從而激活Ca2+Mg2+依靠性核酸內切酶，引起凋亡.

左旋卡尼汀本身并不是機體的基本營養(yǎng)素，是脂肪酸進入線粒體進行β氧化所必需的輔助因子，可加速轉運長鏈脂肪酸通過線粒體內膜，進入線粒體進行β氧化供能.左旋卡尼汀作為一種有效的氧自由基清除劑，在緩解氧化應激、減少脂質過氧化中均具有明顯的保護功能［7］.

本實驗我們觀察到再灌注早期給予左旋卡尼汀，家兔MI/R過程中SOD活性增加，心肌梗死面積減少，細胞AI下降，Fas蛋白表達減弱，Bcl2蛋白表達增強，表明左旋卡尼汀能抑制MI/R過程中細胞凋亡的發(fā)生.提示在MI/R損傷中，細胞凋亡是可以預防的.驗證了左旋卡尼汀通過調節(jié)Bcl2和Fas抑制心肌細胞凋亡，可能是保護MI/R心肌的重要機制這一假設.

至于左旋卡尼汀抑制MI/R心肌細胞發(fā)生凋亡的機制，可能和左旋卡尼汀提高SOD活性，減輕細胞內Ca2+超載，抗缺血，缺氧，減少氧自由基生成、增強細胞抗氧化損傷能力，從而發(fā)揮其抗氧化、抗凋亡的細胞保護功能.另外心肌缺血后，脂肪酸，如棕櫚酸鹽在血漿和心肌組織中生成增多，而棕櫚酸鹽被認為能促進心肌細胞凋亡［8］，棕櫚酸鹽通過調控棕櫚酰激酶（palmitoy1COA）介導的線粒體膜通透性的變化在細胞凋亡中發(fā)揮功能［9］.

【參考文獻

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