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篇1

1、細(xì)胞的分化是在一定條件下，可以分化成多種功能的APSC多能細(xì)胞。細(xì)胞的分化是指在個(gè)體發(fā)育中，由一個(gè)或一種細(xì)胞增殖產(chǎn)生的后代，在形態(tài)，結(jié)構(gòu)和生理功能上向著不同方向穩(wěn)定變化的過程。那些形態(tài)的相似，結(jié)構(gòu)相同，具有一定功能的細(xì)胞群叫做組織

2、細(xì)胞的分化是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，也是當(dāng)今生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。由一個(gè)受精卵發(fā)育而成的生物體的各種細(xì)胞，在形態(tài)，結(jié)構(gòu)和功能上會(huì)有明顯的差異，這和細(xì)胞的分化有關(guān)。

（來源：文章屋網(wǎng) ）

篇2

【摘要】

目的 探討小鼠精原干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化樣細(xì)胞的可行性。方法 以7～8日齡小鼠為材料，采用小鼠支持細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，應(yīng)用維甲酸誘導(dǎo)、成年小鼠組織液誘導(dǎo)以及低溫誘導(dǎo)精原干細(xì)胞分化，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析誘導(dǎo)樣細(xì)胞的染色體倍性。采用顯微注射法將樣細(xì)胞注射到卵母細(xì)胞和去核卵母細(xì)胞，觀察受精卵的發(fā)育狀況。結(jié)果 三種方法誘導(dǎo)樣細(xì)胞比例分別為5.9%、1.6%、0.35%；流式細(xì)胞儀分析維甲酸誘導(dǎo)單倍體比率為19.3%；誘導(dǎo)樣細(xì)胞能激活卵母細(xì)胞，囊胚發(fā)育率20.36%。結(jié)論 新生小鼠精原干細(xì)胞體外可以誘導(dǎo)分化為樣細(xì)胞，并具有激活卵母細(xì)胞的能力。

【關(guān)鍵詞】 精原干細(xì)胞 分化 單倍體 小鼠

Abstract: Objective To discuss the possibility of SSCs of Newly-born mice inducing the differentiating Sperm-like cells. Methods Taking the testis of male mice of 7～8 days for material and adopting the testis of mice ， SSCs differentiating were induced by using retinoic acid， tissue fluid of adult mice and low temperature. Flow cytometry was used to analyse the ploidy of chromosome inducing sperm-like cells. Microinjection was used to inject the sperm-like cells into oocytes and enucleate oocytes to observe the development situation of zygotes. Results The proportions of sperm-like cells induced by the three methods were 5.9%，1.6%，0.35% respectively. The rate of Flow cytometry to analyse retinoic acid haploid is 19.3% .The sperm-like cells achieved could activate bovine oocytes by sperm injection (ICSI)， and the development rate of blastosphere was 20.36%. Conclusions SSCs of newly -born mice can be induced and differentiated into sperm-like cells and are also capable of activating oocytes.

Key words:SSCs; differentiating; haploid; mice

在生精過程中，原始生殖細(xì)胞在胚胎期遷移到生殖嵴，經(jīng)有絲分裂，迅速增殖形成精原干細(xì)胞（spermatogoial stem cells， SSCs），然后進(jìn)一步形成精原細(xì)胞。吳應(yīng)積等［1］利用曲細(xì)精管體外共培養(yǎng)法長(zhǎng)期培養(yǎng)精原干細(xì)胞自分化為樣細(xì)胞，另外應(yīng)用外源基因修飾的雄性生殖細(xì)胞系或青春期的精原干細(xì)胞也可分化出樣細(xì)胞［2－5］，通過體內(nèi)移植使無內(nèi)源性的動(dòng)物產(chǎn)生。但在體外研究SSCs誘導(dǎo)的很少，某些雄性性原細(xì)胞可以直接分化成精原細(xì)胞［6］，這提示具有一少部分雄性性原細(xì)胞維持在干細(xì)胞狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)通過體外誘導(dǎo)新生小鼠SSCs分化為樣細(xì)胞，探討不同誘導(dǎo)方法的誘導(dǎo)效率；采用顯微注射法將樣細(xì)胞注射到卵母細(xì)胞和去核卵母細(xì)胞，探討其體外重構(gòu)胚的發(fā)育能力，為SSCs體外分化研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)7～8 日齡雄性昆明乳鼠(遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.1.2 材料 碘化丙錠（propidium iodide， PI）維甲酸（retinoic acid，RA）、EGF（epidermal growth factor）、二氫睪酮（dihydrotestosterone）、促卵泡生成素（follicle stimulating hormone）均為SIGMA公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)液的配制

A 基礎(chǔ)培養(yǎng)液 DMEM+10% FBS培養(yǎng)液+6 mM 谷氨酰胺+0.5 mM 丙酮酸鈉+0.1%非必需氨基酸+10 ng/mL EGF+10 ng/mL 類胰島素樣生長(zhǎng)因子+500 ng/mL促卵泡生成素+133 mIU人生長(zhǎng)激素+ 5 mg/mL胰島素+5 mg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白+5 mM維生素A+ 0.1 mM視黃醛+ 0.1 mM睪酮+0.1 mM二氫睪酮+0.01% 核苷+0.5% 青霉素。

B 條件培養(yǎng)液 基礎(chǔ)培養(yǎng)液+30% 成年小鼠組織浸提液。

1.2 方法

1.2.1 SSCs的獲取

采用組合酶消化法分離SSCs，采用支持細(xì)胞和SSCs共培養(yǎng)的方法培養(yǎng)，接種密度為1.0×105/mL，每周換液體2 次。

1.2.2 SSCs的誘導(dǎo)

A.RA誘導(dǎo) 原代培養(yǎng)用基礎(chǔ)培養(yǎng)液，添加10-5 mol/L RA處理48 h，培養(yǎng)4 d，更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)，定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，顯微鏡觀察照相。

B.條件培養(yǎng)液誘導(dǎo) 原代培養(yǎng)用基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，3 d換上條件培養(yǎng)液（50% 細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液+50% 組織浸提液培養(yǎng)液），37 ℃ 培養(yǎng)，每2～3 d半量換液1 次，定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，顯微鏡觀察照相。

C.低溫培養(yǎng)誘導(dǎo) 原代培養(yǎng)用基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，37.8 ℃培養(yǎng)3 d，然后34.8 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d半量換液1 次，定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，顯微鏡觀察照相。

1.2.3 新生小鼠SSCs向樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化檢測(cè)

A.流式細(xì)胞儀分選誘導(dǎo)細(xì)胞及DNA倍性分析 根據(jù)細(xì)胞核DNA含量，利用在碘化丙啶(PI)染色區(qū)分RA誘導(dǎo)體系中的細(xì)胞群［7，8］。

B.卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)授精(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)試驗(yàn) 用濃度為0.2% 的透明質(zhì)酸酶消化卵丘，去卵丘后選擇有第一極體的成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行ICSI。對(duì)照組用支持細(xì)胞作供體細(xì)胞重構(gòu)核移植胚胎和孤雌激活胚胎，顯微鏡下觀察受精卵的發(fā)育狀況。

C.RT-PCR分析 利用RT-PCR檢測(cè)新分化的懸浮細(xì)胞PRM-2、TP1、TP2這三個(gè)單倍體的特異性標(biāo)志基因，引物設(shè)計(jì)見表1。PCR擴(kuò)增采用94.8 ℃ 3 min，94.8 ℃ 1 min，57、58、59.8 ℃(TP2， PRM-2，TP1) 1 min，72.8 ℃ 1 min。用作陽性對(duì)照，成纖維細(xì)胞作陰性對(duì)照。

表1 RT-PCR 引物靶基因（略）

2 結(jié)果

2.1 不同誘導(dǎo)方法結(jié)果

采用三種方法誘導(dǎo)新生小鼠SSCs向單倍體分化，結(jié)果在不同時(shí)間內(nèi)均能出現(xiàn)類似樣細(xì)胞和形態(tài)較大的圓形細(xì)胞，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的新生小鼠SSCs，可以形成具有尾巴的樣結(jié)構(gòu)細(xì)胞，不同方法誘導(dǎo)產(chǎn)生具有尾巴樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞的時(shí)間和比例有一定差異（表2）。

表2 不同方法誘導(dǎo)新生小鼠SSCs形成樣細(xì)胞比例（略）

表中不同肩標(biāo)代表不同處理間經(jīng)方差分析比較差異顯著（P＜0.05)

2.2 誘導(dǎo)樣細(xì)胞培養(yǎng)特性

2.2.1 RA誘導(dǎo) SSCs與支持細(xì)胞共培養(yǎng)，接種后2～3 h支持細(xì)胞開始貼壁，12 h完全貼壁并伸出短偽足，SSCs 24 h后貼于支持細(xì)胞表面，但不牢固，輕輕吹打有SSCs游離出來，SSCs開始細(xì)胞呈圓形或橢圓形，RA誘導(dǎo)后培養(yǎng)至4 d，許多具有單突起的細(xì)胞貼于細(xì)胞層上或懸浮于培養(yǎng)液中，形態(tài)與具有尾巴的細(xì)胞相似，其細(xì)胞體形態(tài)橢圓形、三角形、圓形和梭形。圓形細(xì)胞體較小，尾巴較短，這種形狀的細(xì)胞相對(duì)較少（圖1A）；橢圓圓形細(xì)胞具有單鞭毛或另一端有突起細(xì)胞體較大，尾巴細(xì)長(zhǎng)（圖1B），而梭形細(xì)胞多出現(xiàn)雙突起（圖1C），培養(yǎng)7 d，樣細(xì)胞和圓形細(xì)胞增多（圖1D）。

2.2.2 條件培養(yǎng)液誘導(dǎo) 原代培養(yǎng)用基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，支持細(xì)胞能迅速貼壁，SSCs貼附于支持細(xì)胞表面，4 d后形成克隆突起明顯的克隆，加入條件培養(yǎng)液后3 d，在SSCs集落周圍，出現(xiàn)圓形或橢圓形的細(xì)胞，細(xì)胞較SSCs大，部分細(xì)胞懸浮，游離的很少（圖1E），貼壁的圓形細(xì)胞搖動(dòng)培養(yǎng)皿或輕輕吹打即脫離支持細(xì)胞。圓形的細(xì)胞較多，但具有樣形態(tài)的細(xì)胞很少。

2.2.3 低溫培養(yǎng)誘導(dǎo) 用基礎(chǔ)培養(yǎng)液37.8 ℃培養(yǎng)3 d，有克隆產(chǎn)生，轉(zhuǎn)為34.8 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)6 d后在集落周圍有少量散在的圓形細(xì)胞，個(gè)別細(xì)胞有鞭毛（圖1F）。

2.3 流式細(xì)胞儀分揀樣細(xì)胞

收集上述誘導(dǎo)產(chǎn)生的懸浮細(xì)胞，以未定向誘導(dǎo)細(xì)胞作為對(duì)照，處理用PI熒光染料染色，流式細(xì)胞儀分揀見圖2。

細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析顯示，誘導(dǎo)細(xì)胞明顯的3類細(xì)胞群，在DNA直方圖出現(xiàn)了明顯三個(gè)峰中，包括單倍體細(xì)胞峰、二倍體細(xì)胞峰和四倍體細(xì)胞峰，也可見細(xì)胞染色體碎片形成其他小峰。而對(duì)照組小鼠成纖維細(xì)胞出現(xiàn)2個(gè)細(xì)胞類群，對(duì)照顯示出現(xiàn)的2峰為二倍體細(xì)胞峰和四倍體細(xì)胞峰，對(duì)照組出現(xiàn)一個(gè)細(xì)胞峰位單倍體峰，因此認(rèn)為所收集的懸浮細(xì)胞中含有單倍體細(xì)胞，約占所有懸浮細(xì)胞（檢測(cè)細(xì)胞）總數(shù)的19.3%。

2.4 卵母細(xì)胞體外顯微授精試驗(yàn)

將具有樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，注入成熟培養(yǎng)24 h未被激獲的小鼠卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中，對(duì)照組注射支持細(xì)胞和孤雌胚胎，胚胎發(fā)育情況結(jié)果如表3。

表3 小鼠卵母細(xì)胞體外顯微授精胚胎發(fā)育結(jié)果（略）

表中一列中不同肩標(biāo)表示經(jīng)方差分析差異顯著（P

表3顯示，誘導(dǎo)樣細(xì)胞可以使小鼠卵母細(xì)胞卵裂并進(jìn)一步發(fā)育為囊胚，其卵裂率、8/16細(xì)胞胚比率高于支持細(xì)胞重構(gòu)胚的卵裂率（P

2.5 RT-PCR分析

經(jīng)過RT-PCR分析，誘導(dǎo)的樣細(xì)胞表達(dá)PRM-2（282bp）、TP1（175bp）、TP2（152bp）這三個(gè)單倍體的特異性標(biāo)志基因，見圖4。

3 討論

SSCs來源于原始生殖細(xì)胞，來源于胚胎的生殖干細(xì)胞可以在體外，經(jīng)RA誘導(dǎo)形成SSCs，體內(nèi)移植后，形成的SSCs可在無內(nèi)源精原干細(xì)胞的曲細(xì)精管種克隆增殖，直接參與發(fā)生的減數(shù)分裂過程。已有研究證實(shí)維甲酸在分化精原細(xì)胞中起著一定作用，精原細(xì)胞和支持細(xì)胞均有RA的核受體，還不清楚RA的促分化作用是直接的還是經(jīng)由支持細(xì)胞間接執(zhí)行的。本試驗(yàn)用RA誘導(dǎo)SSCs生成樣細(xì)胞，并且用成年小鼠組織液作為條件培養(yǎng)液同樣獲得了樣細(xì)胞，成年小鼠內(nèi)復(fù)雜的促進(jìn)生成的成分可能在體外誘導(dǎo)樣細(xì)胞方面發(fā)揮了重要作用。另外，我們低溫培養(yǎng)法也使SSCs生成樣細(xì)胞，因?yàn)榈纳稍趦?nèi)，的溫度接近35　℃，所以模擬生成的溫度能促進(jìn)SSCs生成樣細(xì)胞。

流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的DNA含量，是通過檢測(cè)插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)堿基對(duì)的核酸熒光染料被激發(fā)后的熒光強(qiáng)度得以實(shí)現(xiàn)。與正常小鼠成纖維細(xì)胞位置一致的DNA單峰為DNA二倍體。偏移預(yù)期正常二倍置5 %的峰應(yīng)疑為異倍體［9］。流式細(xì)胞儀用于細(xì)胞的分揀，即2倍體細(xì)胞類群和4倍體細(xì)胞類群［10］，而減數(shù)分裂過程中，生精上皮細(xì)胞，還含有單倍體細(xì)胞。通過流式細(xì)胞儀分揀，可以對(duì)檢測(cè)的細(xì)胞中是否含有單倍體細(xì)胞進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)利用流式細(xì)胞儀測(cè)定了體外誘導(dǎo)小鼠SSCs生成樣細(xì)胞的DNA含量，結(jié)果表明所獲得的誘導(dǎo)細(xì)胞含有單倍體細(xì)胞，約占檢測(cè)細(xì)胞的19.3%。

體外顯微受精試驗(yàn)，將獲得的樣細(xì)胞注入成熟卵母細(xì)胞胞漿中，觀察卵裂狀況，可以證明生物學(xué)活性［11］，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了SSCs體外誘導(dǎo)樣細(xì)胞在體外受精胚胎的發(fā)育能力，誘導(dǎo)樣細(xì)胞激活卵母細(xì)胞成功率為71.25%，囊胚發(fā)育率為20.36。實(shí)驗(yàn)證明小鼠SSCs在體外可以誘導(dǎo)分化為樣細(xì)胞，并且可以激活卵母細(xì)胞體外發(fā)育到囊胚。（此文圖1－4見附頁6）（略）

參考文獻(xiàn)

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篇3

【關(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細(xì)胞;心肌細(xì)胞;細(xì)胞替代治療

Research advances of mesenchymal stem cells induced into cardiomyocyets

JIANG Jing,LI De-hua.Department of Anatomy,Liao Ning Medical College,Jin Zhou Liao Ning 121001,China

【Abstract】 Ischemic heart disease such as myocardial infarction endanger human health and life,cardiac tissue engineering is one of the new radical therapy for myocardial infarction.In recent years,researchers have made great progress in cardiac tissue engineering,but the problems of seed cells and scaffold materials are far from resolved.This paper reviews research advances of mesenchymal stem cells induced into cardiomyocyets so that it may contribute to Cell therapy.

【Key words】

Mesenchymal Stem Cells;Cardiomyocyets;Cell therapy

在成人肌肉組織中,心肌細(xì)胞(Cardiomyocytes,CMs)屬于終末分化期永久性細(xì)胞,不具有再生能力[1],其對(duì)有絲分裂信號(hào)作出的反應(yīng)是細(xì)胞肥大[2]而不是再生,致使損傷后心肌再生和修復(fù)嚴(yán)重受限,由于心肌損傷后無法通過自身的增殖、分化進(jìn)行修復(fù),壞死的心肌則由纖維疤痕組織取代[3,4]。研究發(fā)現(xiàn)心肌中也含有干細(xì)胞[5-7],在心肌梗死(Myocardial infarction,MI)后這些細(xì)胞會(huì)發(fā)生分裂增生,但數(shù)量極少,增殖能力太小,不能完整地修復(fù)心肌組織,更不能滿足心肌組織再生的需求,致使具有收縮功能的CMs減少,最終發(fā)展成充血性心力衰竭、死亡,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。臨床上缺乏對(duì)病變冠狀動(dòng)脈的再造和梗死心肌的再生、重建的根本治療方法,而細(xì)胞替代治療通過移植功能細(xì)胞,替代、修復(fù)或加強(qiáng)受損的組織或器官的細(xì)胞的生物學(xué)功能已成為治療多種組織壞死性疾病的新策略。

1 心肌細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn)

心肌細(xì)胞在出生后就進(jìn)入了有絲分裂的后期,基本喪失了增生和再生的能力,不再進(jìn)入細(xì)胞周期,而目前尚無證據(jù)支持心肌中含有干細(xì)胞[1]。成人骨髓中含有造血細(xì)胞和非造血細(xì)胞,非造血細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)一起形成了支持造血的骨髓微環(huán)境(Bone marrow microenvironment,BMME)[8]。骨髓微環(huán)境中的細(xì)胞成分包括網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維樣細(xì)胞[9],這些細(xì)胞通過分泌各種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、以及自身細(xì)胞表面受體的表達(dá),對(duì)造血細(xì)胞的附著、分化、自我更新起到了重要作用[10]。目前,普遍認(rèn)為,在骨髓中至少存在兩種干細(xì)胞群即造血干細(xì)胞(Haematopoietic stem cells,HSCs)和MSCs,前者是所有造血細(xì)胞的祖細(xì)胞[11,12],后者則是中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞,這類細(xì)胞可以通過體外貼壁培養(yǎng)加以分離,不僅能分化為造血實(shí)質(zhì)和基質(zhì)細(xì)胞等,還分化為多種造血以外的組織,特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源組織的細(xì)胞,如脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、CMs、神經(jīng)細(xì)胞等[13-16],MSCs向多種細(xì)胞分化及其誘導(dǎo)條件見表1。由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)作為骨髓中存在的另一種非造血干細(xì)胞的干細(xì)胞群具有易獲得、易分離、易操作的優(yōu)點(diǎn)。能夠通過骨髓穿刺反復(fù)收集、體外大量擴(kuò)增,取材方便,擴(kuò)增后自體回輸,不必應(yīng)用免疫抑制劑,成為近年來最具吸引力的心肌種子細(xì)胞,具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。采用生物學(xué)技術(shù)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行自體心肌內(nèi)移植,修復(fù)損傷心肌組織是近年來心血管病研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。

表1

MSCs向多種細(xì)胞分化的誘導(dǎo)條件

細(xì)胞類型誘導(dǎo)物質(zhì)或細(xì)胞因子

成骨細(xì)胞地塞米松,β-磷酸甘油,1,25-(OH)2-D3,抗壞血酸,BMPs(骨形態(tài)蛋白)

骨髓基質(zhì)血清,PDGF,Hydrocrtisone(皮質(zhì)醇)

肌腱BMPs,GDFs

肌肉組織5-Aza(5-氮胞苷),PDGF(血小板衍生生長(zhǎng)因子),bFGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)

軟骨細(xì)胞高密度壓片培養(yǎng),無血清培養(yǎng)基,地塞米松,抗壞血酸,TGF-β,BMPs

脂肪細(xì)胞地塞米松,IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤),Indomethacin(消炎痛)

2 國外研究趨勢(shì)

1999年Makino等[17]首次報(bào)道MSCs體外成功地向CMs誘導(dǎo)分化,這是一個(gè)具有里程碑意義的研究。他們用3μM的

作者單位:121001錦州,遼寧醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室

5-氮胞苷(5-Azacytidine,5-Aza)對(duì)從小鼠骨髓中分離出的MSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-Aza處理1周后,大約30%的MSCs細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞體積變大,呈球狀或向同一方向延展成棒狀,2周后與周圍細(xì)胞相連,3周后細(xì)胞間通過閏盤相連并形成肌管,出現(xiàn)CMs表型,部分細(xì)胞克隆可出現(xiàn)自發(fā)性收縮;透射電鏡觀察顯示心肌終端樣結(jié)構(gòu),形成的肌管結(jié)構(gòu)中包括典型的肌小節(jié)、豐富的糖原顆粒;RT-PCR及Southern blot顯示誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)心鈉素(ANP)、腦鈉素(BNP)、α-MHC、β-MHC、MLC-2v、α-骨骼肌肌動(dòng)蛋白及α-心肌肌動(dòng)蛋白;免疫細(xì)胞化學(xué)染色Myosin、Actin及Desmin陽性;并且誘導(dǎo)的細(xì)胞有著幾種不同的動(dòng)作電位,最為典型的是竇房結(jié)樣和心室肌樣動(dòng)作電位;整個(gè)的研究表明小鼠MSCs分化為完全成熟且具有興奮性、能自發(fā)跳動(dòng)的CMs,并且構(gòu)建出誘導(dǎo)后的心肌細(xì)胞系(Cadiomyocyte cell lines)。這一研究所建立的心肌細(xì)胞系為BMSCs移植在缺血性心臟病的治療提供了應(yīng)用基礎(chǔ)。2000年,Wang等的研究表明,如果BMSCs在體外不經(jīng)過肌細(xì)胞分化誘導(dǎo),移植到正常心肌組織中也能夠產(chǎn)生“環(huán)境依賴性分化”,表達(dá)心臟的表型。然而,Tomita等在大鼠的冷凍心肌梗死模型上發(fā)現(xiàn),只有預(yù)先體外化學(xué)誘導(dǎo)的BMSC細(xì)胞才能改善2個(gè)月后的心臟功能,因此,BMSCs是否必須經(jīng)過體外的預(yù)誘導(dǎo)才能在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞尚無定論[18]。2001年,Orlic等選用eGFP高表達(dá)的雄性轉(zhuǎn)基因小鼠,從骨髓中篩選、培養(yǎng)擴(kuò)增的造血干細(xì)胞譜系特異性抗原陰性(Lin-)而干細(xì)胞因子陽性(c-kit+)的原始干細(xì)胞,冠脈夾閉5 h后注射之急性梗死邊緣的正常心肌組織內(nèi),9 d后在新修復(fù)的心肌塊中,來源于血液干細(xì)胞的新的心肌細(xì)胞達(dá)到近70%。新修復(fù)的心肌組織中包括了心肌細(xì)胞和新生血管。在12只存活小鼠中發(fā)現(xiàn),移植細(xì)胞(表達(dá)GFP,成綠色熒光)分化為形態(tài)較小的肌細(xì)胞,與胚胎和新生肌細(xì)胞相似,不僅Y染色體陽性,還可以表達(dá)一些肌特異性蛋白包括心臟肌凝蛋白,以及轉(zhuǎn)錄因子GATA4/MEF2和Csx/Nkx2.5。這些細(xì)胞同時(shí)也表達(dá)閏盤蛋白connexin43。BrdU摻入分裂細(xì)胞DNA及核內(nèi)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白K167的表達(dá)提示肌細(xì)胞存在增殖分裂。在新生心肌組織中也發(fā)現(xiàn)有新生血管的形成。在新生的毛細(xì)血管和小動(dòng)脈中存在eGFP陽性的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,分別表達(dá)Ⅷ因子和α平滑肌肌動(dòng)蛋白。而骨髓Lin-c-kit-細(xì)胞移植到損傷心肌中沒有發(fā)生心肌再生。血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)提示Lin-c-kit+細(xì)胞移植后可改善左心功能。這些體內(nèi)試驗(yàn)的研究結(jié)果表明,高度富集的成體骨髓Lin-c-kit+細(xì)胞移植能在梗死區(qū)分化、增殖,形成大量的心肌細(xì)胞群,小動(dòng)靜脈和毛細(xì)血管,并與受體心肌細(xì)胞、血管連接,與受體心臟融為一體,顯著改善心臟功能[19]。2002年,Tomita和同事們繼續(xù)觀察了自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植對(duì)大動(dòng)物的心肌再生作用。采用縮窄環(huán)建立豬的左冠狀動(dòng)脈前降支(left anterior descending artery,LAD)遠(yuǎn)端心肌梗死模型,抽取髂骨骨髓,分離基質(zhì)細(xì)胞,體外培養(yǎng),5-氮胞苷誘導(dǎo)分化,在冠脈閉塞后4周行SPECT檢查,心肌梗死區(qū)注射1×108個(gè)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BrdU標(biāo)記),冠脈閉塞后8重復(fù)SPECT檢查,并進(jìn)行心肌形態(tài)學(xué)和組織學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)在梗死區(qū)移植細(xì)胞呈島狀分布,具有橫紋和Z帶,表達(dá)心肌肌鈣蛋白I(cTn I),在移植區(qū)由有更大的血管密度,SPECT發(fā)現(xiàn)治療組的射血分?jǐn)?shù)、局部灌注及室壁運(yùn)動(dòng)明顯改善,壓力-容積分析顯示收縮彈性末期彈性和左室舒張末期壓力均有改善,提示自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植可形成島狀心肌細(xì)胞,促進(jìn)血管新生,防止左室重塑,提高局部及全心的收縮功能[20]。2002年,Shake等采用犬LAD結(jié)扎60 min的心肌梗死模型,心肌梗死后2周將6×107個(gè)BMSCs注射到心肌梗死區(qū),移植后4周心臟收縮功能改善,提示MSC具有心肌再生的作用?？赏蔀榕R床上治療心肌梗死的有效方法[21]。2005年Yoon等把hBMSCs和新生鼠的心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)。誘導(dǎo)hBMSCs向心肌細(xì)胞分化。表達(dá)心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白基因如α肌球蛋白重鏈基因(α-MHC),以及心肌細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5,CATA4和心鈉素(ANP)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)證實(shí)了hMSCs有向心肌分化的潛能。[22]

3 國內(nèi)研究趨勢(shì)

韓永生,等人(2004)將大鼠基質(zhì)細(xì)胞注入同源的大鼠的心臟中。發(fā)該細(xì)胞表達(dá)肌球蛋白重鏈和連接蛋白43,后者的表達(dá)提示了細(xì)胞間隙連接的形成。為了明確hBMSCs是否能夠植入梗死組織區(qū)域。筆者用注射器直接將hBMSCs注入無胸腺大鼠的實(shí)驗(yàn)性心梗模型中。在此實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中筆者發(fā)現(xiàn)hBMSCs能移植入梗死組織區(qū)域并存活至少兩個(gè)月。同時(shí)還表達(dá)橫紋肌蛋白。為滿足人類的治療需求,還進(jìn)行了另外一些研究即在豬的心梗模型的基礎(chǔ)上發(fā)展hBMSCs移植的方法和技術(shù)。盡管許多工作有待進(jìn)一步進(jìn)行,但現(xiàn)有的結(jié)果顯示植入的hBMSCs能分化出心肌細(xì)胞表型,并在心臟組織受損或缺血時(shí)能促進(jìn)細(xì)胞性的心臟形成術(shù)[23]。賈紹斌等用大鼠BMSCs在誘導(dǎo)劑5-aza的作用下,可以向心肌樣細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化。形態(tài)學(xué)上BMSCs在5-aza干預(yù)后,細(xì)胞由原來扁平多角形變成長(zhǎng)梭形,部分細(xì)胞體積明顯增粗,可見到有些細(xì)胞間有融樣發(fā)生,可以有類似肌管樣細(xì)胞出現(xiàn)。通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)BMSC經(jīng)過誘導(dǎo)后與誘導(dǎo)前完全不同,前著表達(dá)心肌特異的ANP和BNP基因,此現(xiàn)象揭示誘導(dǎo)后BMSC可向心肌細(xì)胞分化[24]。呂鐵偉等多人誘導(dǎo)BMSCs分化成心肌細(xì)胞,可觀察到BMSCs向心肌細(xì)胞樣形態(tài)的改變明顯[25,26,27],免疫組化顯示cTnI表達(dá)陽性率高。說明5-aza能夠誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。熒光免疫組化方法鑒定心肌特征性蛋白肌球蛋白重鏈(MHC)和連接蛋白Connexin43的表達(dá),應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)分析TGF-β、Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C、TEF-1和RARα等相關(guān)調(diào)控基因在分化過程中的動(dòng)態(tài)時(shí)序表達(dá)。考慮TGF-β、Nkx-2.5、GATA-4和MEF-2C可能是調(diào)控BMSCs定向分化為心肌樣細(xì)胞的重要調(diào)控基因。為進(jìn)一步細(xì)胞移植治療心肌梗死,改善心功能提供了理論基礎(chǔ),為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持[28,29]。

汪蕾等(2004)觀察心肌細(xì)胞(cardiomyocytes,CM)與BMSCs直接接觸和非直接接觸對(duì)誘導(dǎo)BMSCs成心肌樣分化的影響。體外以新生大鼠CM與BMSCs直接接觸和非直接接觸的培養(yǎng)方式模擬心肌微環(huán)境,分析BMSCs形態(tài)和結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)等方面的變化。結(jié)果:直接接觸共培養(yǎng)的BMSCs與CM同步搏動(dòng),且心肌特異性肌鈣蛋白T染色陽性,陽性率為1.3%;而心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液無法單獨(dú)誘導(dǎo)BMSCs的橫向分化得出結(jié)論:與CM細(xì)胞間的直接接觸是誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌細(xì)胞的必須條件,條件培養(yǎng)液則非關(guān)鍵因素[30,31]。郭軍等(2004)探討粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和干細(xì)胞因子(SCF)預(yù)處理對(duì)BMSCs向心肌細(xì)胞分化具有促分化作用[32]。

楊志健等體外誘導(dǎo)出能自發(fā)跳動(dòng)的心肌細(xì)胞,使采用BMSC修復(fù)心肌損傷成為心血管疾病的研究熱點(diǎn)。研究利用BMSC可誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的特點(diǎn),以幼豬為研究對(duì)象,采用經(jīng)冠脈轉(zhuǎn)運(yùn)的方法,將培養(yǎng)的自體BMSC移植至心肌梗死區(qū),觀察BMSC在心肌微環(huán)境下的轉(zhuǎn)歸及治療作用[33-35]。

我國唯一2004年劉維新等人從轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)到翻譯后水平的證據(jù)均不支持體外5-aza處理可誘導(dǎo)BMSCs表達(dá)心肌特異性蛋白[36]。

4 問題與展望

大量的細(xì)胞體外培養(yǎng)誘導(dǎo)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn),為細(xì)胞移植治療心血管疾病提供了可能性和科學(xué)依據(jù),充分說明MSCs作為心肌干細(xì)胞的來源,具有重要的臨床意義和良好的應(yīng)用遠(yuǎn)景。目前,干細(xì)胞在心血管疾病的研究中還處于臨床前實(shí)驗(yàn)階段,對(duì)于干細(xì)胞在心血管疾病中作用的認(rèn)識(shí)也僅是初步的,還存在很多問題亟待解決,如移植的最佳部位和時(shí)機(jī)?對(duì)于不同程度的心肌損傷采用細(xì)胞移植的數(shù)量如何量化?嚙齒類動(dòng)物模型能否準(zhǔn)確反應(yīng)人類心臟的狀態(tài)和移植后的反應(yīng)?在心血管疾病狀態(tài)中病理作用下對(duì)植入的干細(xì)胞的影響?源于植入細(xì)胞的新生CMs是否具有完整的功能以及它們的壽命?移植后其分化能力能保持多久?替代組織的功能能維持多久?是否能改善心室重構(gòu)從而改善心血管疾病的遠(yuǎn)期預(yù)后?如何避免植入干細(xì)胞受損,增加干細(xì)胞的數(shù)量,糾正干細(xì)胞的異常?盡管如此,可以預(yù)見,隨著干細(xì)胞研究的深入,應(yīng)用最近發(fā)展的組織工程學(xué)技術(shù)和干細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù),將間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞,在體外構(gòu)建組織工程化心肌組織,為心臟外科手術(shù)治療心臟病,提供了一種全新的思路和治療策略。不久的將來,MSCs的移植將會(huì)給心血管疾病的治療帶來巨大變革。

參 考 文 獻(xiàn)

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篇4

【摘要】 目的 探討兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞﹙bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs﹚體外分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的方法，并研究其生物學(xué)特性。方法 采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)自兔股骨、脛骨及肱骨中分離BMSCs進(jìn)行純化、培養(yǎng)。用地塞米松、β甘油磷酸鈉、維生素C定向誘導(dǎo)BMSCs分化為成骨細(xì)胞，改良MTT法測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，NBT/BCIP染色法、P對(duì)硝基苯基質(zhì)法及茜素紅染色法檢測(cè)BMSCs的成骨能力。結(jié)果 成骨誘導(dǎo)1~5 d，培養(yǎng)的細(xì)胞增殖旺盛，3~5 d即可融合成單層，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖速度減慢，出現(xiàn)細(xì)胞聚集的現(xiàn)象，培養(yǎng)細(xì)胞逐漸匯合呈鋪路石狀，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榘w較小的立方形，繼續(xù)誘導(dǎo)，可出現(xiàn)多角形成骨樣細(xì)胞，胞外基質(zhì)分泌逐漸增多，膠原堆積、鈣鹽沉積，10~12 d形成不透光礦化結(jié)節(jié)，ALP活性增高，茜素紅染色陽性，表示BMSCs向成骨細(xì)胞分化。結(jié)論 兔BMSCs經(jīng)體外分離、誘導(dǎo)培養(yǎng)，可以定向分化為成骨細(xì)胞。

【關(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；誘導(dǎo)分化；成骨細(xì)胞

【Abstract】 Objective To investigate the isolation and cultivation of bone marrow mesenchymal stem cells ﹙BMSCs﹚from the bone marrow of rabbit and induce them to differentiate into osteoblasts in vitro. Methods BMSCs were harvested from the femurs， tibias and humerus bones of the rabbit， then separated， purified and proliferated. After primary culture， the subcultured cells were cultured in osteogenesis inducing medium including dexamethasone， βglycerophosphate， Lascorbic acid， then stained with NBT/BCIP and alizarin red. Results The BMSCs of rabbit showed active proliferative capability in primary and passage cultures. After 8 days of osteoblast inducing， the BMSCs congregated ， showed typical cuboidal shape and formed mineralized nodule. The expression of alkaline phosphatase was positive. Conclusion The BMSCs isolated and cultured can be induced into osteogenesis committed differentiation.

【Key words】 bone marrow mesenchymal stem cells， induced differentiation，osteoblasts

由于腫瘤、外傷和骨骼異常等原因引起的大段骨缺損往往需要骨的重建，目前常規(guī)的方法有自體或異體、異種骨移植，但都存在一定的問題和限制，難以完全滿足臨床需要。組織工程化骨組織的研究為骨缺損修復(fù)開辟了新的途徑，但是在骨組織工程產(chǎn)品進(jìn)入臨床應(yīng)用前，尚存在一些障礙有待克服，其中如何獲得大量種子細(xì)胞是目前面臨的最關(guān)鍵性的制約因素。近年來干細(xì)胞尤其是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞﹙BMSCs﹚的研究為解決這一難題提供了可能。BMSCs是位于骨髓基質(zhì)中的一類中胚層來源的未分化細(xì)胞，具有很強(qiáng)的自我更新和多向分化潛能，在一定誘導(dǎo)條件下，可以分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞等，還可以分化為巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等骨髓基質(zhì)細(xì)胞，具有發(fā)育為骨、軟骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基質(zhì)等中胚層組織的潛能［1~3］。此外，BMSCs具有取材容易，對(duì)機(jī)體損傷小，增殖力強(qiáng)，易穩(wěn)定表達(dá)成骨細(xì)胞表型等優(yōu)點(diǎn)，因此可作為骨組織工程的較好的種子材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：日本大耳兔12只，6~8周齡，雌雄不拘，體重（250±50）g，由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑和藥品：LDMEM(GIBCO)，HEPES(CXBIO)，胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（BBI），EDTA(CXBIO)，MTT(SIGMA)，三聯(lián)液（10％十二烷基硫酸鈉，5％異丁醇，0.012mol/L鹽酸），地塞米松（SIGMA），β甘油磷酸鈉（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所），維生素C（CXBIO），NBT/BCIP染色試劑盒（SIGMA公司），茜素紅（上海化學(xué)試劑廠） ，ALP（日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社）。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分離、原代和傳代培養(yǎng)：耳緣靜脈注入少許空氣處死日本大耳兔，75% 乙醇內(nèi)浸泡10 min后，無菌條件下逐層切開皮膚及皮下組織，剝離附著于四肢長(zhǎng)骨的肌肉，完整切取雙側(cè)股骨、脛骨和肱骨，PBS沖洗3遍；將各長(zhǎng)骨兩側(cè)干骺端切除，充分顯露骨髓腔，用7號(hào)針頭的注射器吸取不含血清的LDMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，從長(zhǎng)骨的另一端收集沖洗出來的骨髓，用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清和脂肪，加入含20％FBS的LDMEM培養(yǎng)基吹打成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/ml并接種于50 ml培養(yǎng)瓶中，置于37℃，飽和濕度，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。12 h后輕柔搖動(dòng)培養(yǎng)瓶1次，使紅細(xì)胞從底壁上脫離；48 h首次半量換液，棄去部分懸浮細(xì)胞；72 h全換液，以后每2~3 d根據(jù)培養(yǎng)基顏色全量換液。原代培養(yǎng)第8~12天，貼壁細(xì)胞逐漸開始融合并覆蓋培養(yǎng)瓶底面達(dá)80％以上，吸除培養(yǎng)基并用PBS洗滌貼壁細(xì)胞2次，加入025％ 胰蛋白酶和002%EDTA混合消化液 2~3 ml，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面。消化期間倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞收縮變圓，即將脫離瓶壁時(shí)，吸去消化液，立即用含10％FBS的LDMEM培養(yǎng)基終止消化。用彎頭吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基，反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，細(xì)胞脫壁后形成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液收集到離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含10％FBS的LDMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞重新打勻后，按1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 定向誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化：第2、3、5代BMSCs長(zhǎng)至80％融合后，常規(guī)傳代，細(xì)胞以1×104個(gè)/ml密度接種于放置有1 cm×1 cm蓋玻片的24孔板中，細(xì)胞達(dá)到80％融合后，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（LDMEM培養(yǎng)基，10％FBS，Dex 10－8mol/L，βGP 10 mmol/L，Vit C 50 mg/L，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml，pH 7.2）。對(duì)照組繼續(xù)加常規(guī)培養(yǎng)基，每3 d換液一次。誘導(dǎo)期間倒置相差顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖情況及形態(tài)特征，并隨時(shí)拍照記錄。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定：第3代BMSCs長(zhǎng)至80％融合后，常規(guī)傳代，細(xì)胞以1×104 個(gè)/ml密度接種于7塊96孔培養(yǎng)板，每孔90 μl，每板接種16孔，細(xì)胞達(dá)到80％融合后，8孔更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，8孔繼續(xù)加常規(guī)培養(yǎng)基，每3 d換液1次。從第2天起每隔24 h取出一塊培養(yǎng)板，在成脂誘導(dǎo)孔和對(duì)照孔內(nèi)各加入10 μl MTT（5 mg/ml）溶液，置于37 ℃，飽和濕度，5％CO2孵箱培養(yǎng)4 h后取出，每孔加入三聯(lián)液100 μl，再次置于37 ℃，飽和濕度，5％CO2孵箱培養(yǎng)12 h后取出。用酶標(biāo)檢測(cè)儀在570 nm、630 nm雙波長(zhǎng)下測(cè)定各孔光密度（OD）值，連續(xù)測(cè)7次，取8個(gè)孔光密度的平均值，以時(shí)間（d）為橫坐標(biāo)，光密度（OD值，表示細(xì)胞相對(duì)數(shù)量）為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 堿性磷酸酶﹙ALP﹚活性定性檢測(cè)（NBT/BCIP染色法）：分別于成骨誘導(dǎo)的第4、7、14天各取實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組的細(xì)胞爬片PBS沖洗2次，用濾紙吸去多余水份，4％多聚甲醛固定30 min，用NBT/BCIP試劑盒避光染色1 h后，用流水沖洗，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.5 堿性磷酸酶﹙ALP﹚活性定量檢測(cè)（P對(duì)硝基苯基質(zhì)法）：分別于成骨誘導(dǎo)的第4、7、14天，每孔加入少許0.25％ 胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液消化，再加入含10％FBS的LDMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液用超聲粉碎儀粉碎2 min后800 r/min離心8 min，取上清液用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行ALP活性測(cè)定。

1.2.6 鈣結(jié)節(jié)檢測(cè)﹙茜素紅染色﹚：分別于成骨誘導(dǎo)的第4、7、14天各取實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組的細(xì)胞爬片PBS沖洗2次，用濾紙吸去多余水份，95%乙醇固定20~30 min，茜素紅染液中浸染5～10 min后，用流水沖洗，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的原代及傳代培養(yǎng) 原代、傳代細(xì)胞的形態(tài)相似，均有較強(qiáng)的增殖能力。原代培養(yǎng)細(xì)胞剛接種時(shí)，培養(yǎng)瓶中有大量懸浮細(xì)胞，24 h后部分細(xì)胞開始貼壁伸展變形，剛貼壁的細(xì)胞單個(gè)排列，呈圓形或多角形，胞體透亮折光性強(qiáng)；48~72 h后呈紡錘形或梭形，每個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)集落，增殖迅速，集落之間相互靠近；培養(yǎng)4 d后見貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)較大變化，可見成纖維樣細(xì)胞散布于培養(yǎng)瓶底，并有多個(gè)集落形成，細(xì)胞圍繞中心呈漩渦狀排列。5~8 d期間集落逐漸增多，此后逐漸增大，并融合為單層。當(dāng)培養(yǎng)至第9~12 d時(shí)，細(xì)胞已大部分融合，長(zhǎng)滿瓶底，細(xì)胞成長(zhǎng)梭形（成纖維樣外觀），有的細(xì)胞呈交叉重疊生長(zhǎng)。原代細(xì)胞培養(yǎng)8~12 d后，消化傳代，傳代細(xì)胞貼壁較快，剛傳代的細(xì)胞呈圓形。4 h后可見明顯的貼壁細(xì)胞散在分布；24 h見貼壁細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，伸展為短梭形、長(zhǎng)梭形。原代培養(yǎng)局部區(qū)域存在少許小而圓的細(xì)胞，傳代后消失。第3代以后，細(xì)胞形態(tài)趨于一致。傳代細(xì)胞約5 d基本長(zhǎng)滿瓶底，細(xì)胞形態(tài)為成纖維細(xì)胞樣，見圖1、2。

轉(zhuǎn)貼于 2.2 BMSCs誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞的形態(tài)變化 成骨誘導(dǎo)1~5 d，培養(yǎng)的細(xì)胞增殖旺盛，3~5 d即可融合成單層，細(xì)胞形態(tài)仍保持長(zhǎng)梭形，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無明顯差異。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖速度減慢，開始出現(xiàn)細(xì)胞聚集的現(xiàn)象，培養(yǎng)細(xì)胞逐漸匯合呈鋪路石狀，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，由梭形變?yōu)榘w較小的立方形，高倍鏡下可見細(xì)胞呈復(fù)層生長(zhǎng)。繼續(xù)誘導(dǎo)，出現(xiàn)多角形成骨樣細(xì)胞，胞質(zhì)顏色變深，含粗大顆粒，胞核明顯，胞外基質(zhì)分泌逐漸增多，膠原堆積、鈣鹽沉積，10~12 d形成不透光礦化結(jié)節(jié)，見圖3、4。

圖3 成骨誘導(dǎo)第8天，細(xì)胞重疊生長(zhǎng)，

出現(xiàn)細(xì)胞聚集的現(xiàn)象﹙×100﹚圖4 成骨誘導(dǎo)第10天，形成不透光的

鈣化結(jié)節(jié)﹙×100﹚ 2.3 生長(zhǎng)曲線分析﹙改良MTT法﹚ 第3代BMSCs的生長(zhǎng)曲線見圖5。對(duì)照組生長(zhǎng)曲線呈S形，傳代接種后第1、2天細(xì)胞增殖緩慢為潛伏適應(yīng)期，從第3天開始細(xì)胞增殖加速，細(xì)胞數(shù)目呈指數(shù)級(jí)遞增，此期為BMSCs的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。至第7天達(dá)到頂點(diǎn)。成骨誘導(dǎo)組與對(duì)照組第0天的光密度值（OD值）基本相同，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，BMSCs在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，逐漸向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但BMSCs仍具有增殖能力，成骨生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組類似。

圖5 第3代BMSCs的生長(zhǎng)曲線

2.4 堿性磷酸酶﹙ALP﹚活性定性檢測(cè)（NBT/BCIP染色法） 成骨誘導(dǎo)第4天，成骨誘導(dǎo)組部分細(xì)胞染色出現(xiàn)淡藍(lán)紫色，成骨誘導(dǎo)第7天，大部分染色為強(qiáng)陽性，對(duì)照組有部分細(xì)胞染色為淡紫藍(lán)色，見圖6。

A. 對(duì)照組，堿性磷酸酶染色，呈陰性。

B. 成骨誘導(dǎo)組，堿性磷酸酶染色，呈強(qiáng)陽性。

圖6 成骨誘導(dǎo)第7天，堿性磷酸酶染色﹙×100﹚

2.5 堿性磷酸酶﹙ALP﹚活性定量檢測(cè)（P對(duì)硝基苯基質(zhì)法） 各孔細(xì)胞經(jīng)消化、定容、超聲粉碎、離心后，取細(xì)胞上清液用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALP活性，結(jié)果如表1，圖7所示。表1 不同時(shí)間細(xì)胞上清液ALP

2.6 鈣結(jié)節(jié)檢測(cè)﹙茜素紅染色﹚ 成骨誘導(dǎo)的第7天，成骨誘導(dǎo)組可見重疊生長(zhǎng)的細(xì)胞逐漸形成結(jié)節(jié)狀，隨后膠原堆積及鈣鹽沉積，最后形成不透光礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色為棕紅色，而對(duì)照組未見鈣結(jié)節(jié)，茜素紅染色陰性，隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，鈣結(jié)節(jié)明顯增多，見圖8。

3 討論

BMSCs位于骨髓基質(zhì)中，在體外可以通過貼壁培養(yǎng)加以分離，分裂增殖能力強(qiáng)，可以向多種結(jié)締組織細(xì)胞﹙纖維、骨、軟骨、肌腱、肌肉、脂肪等﹚分化，并易于被外源基因轉(zhuǎn)染且穩(wěn)定表達(dá)，因此被認(rèn)為是組織工程理想的種子細(xì)胞、細(xì)胞及基因治療理想的靶細(xì)胞［4］。刺激BMSCs向成骨細(xì)胞分化的物質(zhì)很多［5，6］，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、降鈣素等，其中以Dex、βGP和Vit C聯(lián)合促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的方法最為常用。Vit C是膠原中脯氨酸和賴氨酸末端羥基化的共同影響因子，能通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞特異性分化蛋白基因的表達(dá)來誘導(dǎo)ALP活性的增加。同時(shí)，Vit C能增加鈣鹽的沉積和促進(jìn)鈣化骨結(jié)節(jié)的形成［7］。βGP可為成骨細(xì)胞的分化和增殖提供磷原子，能增加ALP的表達(dá)，促進(jìn)鈣鹽沉積，促進(jìn)鈣化［8］。Dex是BMSCs體外成骨的必需成分，體外培養(yǎng)的BMSCs只有加入Dex才能形成鈣化結(jié)節(jié)［9］。雖然Dex對(duì)BMSCs的增殖有抑制作用，但Dex在抑制BMSCs增殖的同時(shí)可明顯增加ALP的活性，Dex濃度越高作用越明顯［10］。堿性磷酸酶﹙alkaline phosphatase，ALP﹚是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志，在體外鈣化中起關(guān)鍵性作用。目前認(rèn)為，ALP能夠水解有機(jī)磷酸酯，使局部PO43-濃度升高，并可破壞鈣化抑制劑，從而啟動(dòng)鈣化，ALP活性越高，說明前成骨細(xì)胞向成熟成骨細(xì)胞分化越明顯。骨組織是通過骨基質(zhì)鈣化而形成，而骨基質(zhì)由成骨細(xì)胞所合成、分泌；在基質(zhì)開始鈣化時(shí)，成骨細(xì)胞的ALP活性最高，在鈣化接近結(jié)束時(shí)，活性則最低，其活力在一定程度上反映成骨細(xì)胞的分化程度和功能狀態(tài)［11］。本研究采用NBT/BCIP染色法、P對(duì)硝基苯基質(zhì)法及茜素紅染色的方法檢測(cè)BMSCs的成骨能力。NBT﹙硝基藍(lán)四氮唑﹚與SCIP﹙5溴4氯3吲哚磷酸鹽﹚是堿性磷酸酶最佳的底物組合之一，顯色反應(yīng)產(chǎn)物為藍(lán)色，不溶于水、乙醇及二甲苯。本研究選用了此染色方法，發(fā)現(xiàn)隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，染色由淡紫藍(lán)色變?yōu)樯钭纤{(lán)色，ALP的活性檢測(cè)也與之相符。礦化結(jié)節(jié)是鑒定成骨細(xì)胞及其功能的另一重要指標(biāo)，茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)呈橘紅色或棕紅色。本實(shí)驗(yàn)采用Dex、βGP和Vit C聯(lián)合誘導(dǎo)的方法，作用5 d后發(fā)現(xiàn)BMSCs形態(tài)由細(xì)長(zhǎng)梭形逐漸變?yōu)槎嘟切魏头叫?，?xì)胞外基質(zhì)分泌增多，細(xì)胞之間出現(xiàn)明顯的鈣化結(jié)節(jié)。ALP染色發(fā)現(xiàn)ALP表達(dá)陽性，茜素紅染色發(fā)現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)。證實(shí)了兔BMSCs能夠在Dex、βGP和Vit C聯(lián)合誘導(dǎo)下向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并且不影響細(xì)胞的增殖，可迅速大量地獲得細(xì)胞，為骨組織工程提供大量的種子細(xì)胞。兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞﹙BMSCs﹚在體外培養(yǎng)取材容易，對(duì)機(jī)體損傷小，增殖力強(qiáng)，經(jīng)多次傳代，細(xì)胞仍生長(zhǎng)穩(wěn)定、增殖速度快、貼壁率高、適應(yīng)性強(qiáng)、接種成活率高，并且可以定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。因此，可作為骨組織工程的較好的種子材料。

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篇5

關(guān)鍵詞：前脂肪細(xì)胞分化；肥胖

中圖分類號(hào)：R589

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-7717(2007)04-0735-02

隨著生活質(zhì)量的提高，被稱為“文明病”之一的“肥胖病”就應(yīng)運(yùn)而生，無論是國內(nèi)還是國外，體重超重和肥胖病患者呈逐年增加的趨勢(shì)，尤其在兒童中，這一上升趨勢(shì)更加明顯。肥胖不僅影響美觀，使眾多愛美人士背上沉重的心理包袱，而且會(huì)誘發(fā)各種疾病，如高血壓、高血脂、糖尿病等，嚴(yán)重威脅著人們的身心健康，很多人還因此而喪生[1]。由于肥胖病對(duì)人體和社會(huì)的危害巨大，故對(duì)肥胖病的研究必須更加深入，使更多的人免受肥胖的困擾。

在過去的很多年里，人們都認(rèn)為肥胖是由于脂肪細(xì)胞的體積增大所致，最新研究表明，脂肪細(xì)胞的體積不能無限增大，有專家認(rèn)為當(dāng)超過1．2～1．6μg脂肪／細(xì)胞時(shí)，前脂肪細(xì)胞即通過旁分泌被激活，開始增殖和向脂肪細(xì)胞分化，因此前脂肪細(xì)胞的分化使脂肪細(xì)胞快速增生導(dǎo)致脂肪細(xì)胞數(shù)目增多可能是引起肥胖的機(jī)制之一[2]。

前脂肪細(xì)胞分化與肥胖形成是否有密切的關(guān)系，筆者即通過本文對(duì)前脂肪細(xì)胞分化與肥胖形成的關(guān)系進(jìn)行初步探討。

1關(guān)于前脂肪細(xì)胞分化的研究

脂肪細(xì)胞系是由起源于中胚層的多能干細(xì)胞逐步分化、發(fā)育而成，其過程大致為：多能干細(xì)胞間充質(zhì)前體細(xì)胞前脂肪細(xì)胞成熟的脂肪細(xì)胞。脂肪組織在體內(nèi)有在胞漿內(nèi)積聚脂滴的成熟脂肪細(xì)胞和雖未在胞漿內(nèi)積聚脂滴但有這種潛能的前脂肪細(xì)胞。成熟的脂肪細(xì)胞呈圓形，前脂肪細(xì)胞呈梭形，成熟的脂肪細(xì)胞失去分裂及增殖的能力，而前脂肪細(xì)胞則有分裂和增殖的能力。

近幾十年來，各國專家對(duì)前脂肪細(xì)胞及其分化進(jìn)行了廣泛而深入的研究。Smith[3]在1971年首次描述了培養(yǎng)人脂肪組織中的“成纖維細(xì)胞樣”細(xì)胞。Poznanski等[4]對(duì)SVF的系統(tǒng)研究形成了完整的前脂肪細(xì)胞理論，將切下的脂肪組織用膠原酶處理，再將組織懸液離心，其中的沉淀物基質(zhì)血管成分(Stromal Vascular Fraction)就是SVF，將此SVF進(jìn)行培養(yǎng)，和培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞比較，這兩種培養(yǎng)物以差不多的速率增殖，倍增時(shí)間約50h左右，在顯微鏡下比較細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SVF細(xì)胞內(nèi)脂肪聚成大滴，培養(yǎng)液中的細(xì)胞呈散發(fā)生長(zhǎng)，而成纖維細(xì)胞的胞漿內(nèi)只有少量的脂滴，呈螺旋樣生長(zhǎng)。這種具有結(jié)締組織特征的方式，就證明了SVF內(nèi)含有前脂肪細(xì)胞，具有增殖和向成熟脂肪細(xì)胞分化的潛能。在以后的許多研究中，常把SVF作為前脂肪細(xì)胞進(jìn)行研究。

Van等[5]在1976年研究成人的SVF前脂肪細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其具有比皮膚成纖維細(xì)胞更高的脂蛋白脂酶活力；比成纖維細(xì)胞高15倍的甘油三酯合成酶活力，高2倍的脂肪酸合成酶活力，揭示了前脂肪細(xì)胞盡管在普通培養(yǎng)基上與成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)一樣的形態(tài)，但是一旦轉(zhuǎn)移到合適的培養(yǎng)基上即開始積聚脂肪，分化成典型形態(tài)的成熟脂肪細(xì)胞，而同樣條件下的成纖維細(xì)胞則不能[6]。

前脂肪細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件下可向成熟脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在體內(nèi)也是如此，Van等[5]在1982年鼠的SVF細(xì)胞分離出后體外培養(yǎng)5代，用胸腺嘧啶標(biāo)記后回填到同一鼠的肌肉內(nèi)，3~4個(gè)月后形成了大體的脂肪組織。

通過以上的研究證明，脂肪組織中確實(shí)存在一定數(shù)量的前脂肪細(xì)胞，并且該細(xì)胞具有分化為成熟脂肪細(xì)胞的潛能。如果前脂肪細(xì)胞的分化增加可能會(huì)導(dǎo)致成熟脂肪細(xì)胞的數(shù)量增多，進(jìn)而對(duì)肥胖的形成起到一定的作用。

2關(guān)于前脂肪細(xì)胞分化與肥胖形成關(guān)系的探討

脂肪細(xì)胞的數(shù)量在人的一生中有3個(gè)階段增長(zhǎng)最快：①胎兒期后3個(gè)月；②出生后的第1年；③青春生長(zhǎng)旺盛期。身體內(nèi)的脂肪可通過形成新的脂肪細(xì)胞(細(xì)胞增生即數(shù)量增多)和大量貯存于脂肪細(xì)胞內(nèi)(細(xì)胞肥大即體積增大)而積聚于體內(nèi)?？梢娙梭w脂肪細(xì)胞是在生命的早期形成的，直到青春期以后，脂肪細(xì)胞的數(shù)量才停止增長(zhǎng)[7]。

脂肪細(xì)胞的數(shù)量在不同的人有很大的差異，一般的人大約有2500~3000萬個(gè)脂肪細(xì)胞，而特別肥胖的人的脂肪細(xì)胞則可達(dá)到2600億個(gè)。由于脂肪細(xì)胞產(chǎn)生后是不會(huì)減少的，因此，“胖子”是不可能完全治愈的，因?yàn)椤芭肿印钡捏w重減少不會(huì)改變脂肪細(xì)胞的數(shù)量，只是縮小了脂肪細(xì)胞的體積，一旦有機(jī)會(huì)，這些脂肪細(xì)胞的體積還可以恢復(fù)原樣。

很多從兒童時(shí)期開始肥胖的人，其體內(nèi)脂肪細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，而脂肪細(xì)胞數(shù)量的增多經(jīng)證明是由前脂肪細(xì)胞的分化增加導(dǎo)致，由于脂肪細(xì)胞產(chǎn)生后是不會(huì)減少的，因此這樣的肥胖一旦形成后，一般成年后仍然肥胖，治療起來也就比較困難。因此，要想防止機(jī)體產(chǎn)生過多的脂肪細(xì)胞，只能在青春期以前脂肪細(xì)胞數(shù)量尚不恒定時(shí)期養(yǎng)成良好的飲食習(xí)慣和運(yùn)動(dòng)習(xí)慣，而能做到均衡飲食并且喜好運(yùn)動(dòng)的兒童身體內(nèi)形成的脂肪細(xì)胞數(shù)量較少，體積也較小。眾多研究證明前脂肪細(xì)胞的分化增加導(dǎo)致成熟脂肪細(xì)胞的數(shù)量增多，對(duì)肥胖的形成確實(shí)有密切的關(guān)系。

3關(guān)于抑制前脂肪細(xì)胞分化與防治肥胖的可行性分析

由于前脂肪細(xì)胞的分化與肥胖的形成確實(shí)有密切的關(guān)系，故通過一定的方法(如均衡飲食、增加運(yùn)動(dòng)、藥物)抑制前脂肪細(xì)胞分化對(duì)于預(yù)防或治療肥胖尤其是兒童肥胖具有一定的實(shí)際意義。已有研究發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺[8]、小檗堿[9]、維生素[10]等對(duì)前脂肪細(xì)胞的分化有不同程度的抑制作用。

篇6

關(guān)節(jié)軟骨在受到創(chuàng)傷后，難以自行修復(fù)。傳統(tǒng)的治療方法如軟骨下骨鉆孔術(shù)、軟骨移植、骨膜或軟骨膜移植、軟骨細(xì)胞移植等因修復(fù)組織以纖維軟骨為主，缺少正常透明軟骨的力學(xué)性能及耐用性，故不能取得滿意效果。而應(yīng)用組織工程方法修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損卻展示了令人鼓舞的前景。種子細(xì)胞是組織工程化軟骨形成的首要條件。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是來源于骨髓的一群非造血干細(xì)胞，在不同誘導(dǎo)條件下具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能。MSCs因具有易于從骨髓中分離和體外大量擴(kuò)增純化、供區(qū)損傷小、便于自體移植、在適宜的體內(nèi)或體外條件下可分化形成軟骨組織等特點(diǎn)，故被認(rèn)為是軟骨組織工程最有希望的種子細(xì)胞來源之一?，F(xiàn)就影響MSCs向軟骨細(xì)胞表型分化的因素綜述如下。

1 培養(yǎng)方法

目前，絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用低糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行MSCs的分離與擴(kuò)增，少數(shù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用DMEM/F12、αDMEM進(jìn)行，因?yàn)榈吞菞l件比高糖條件更利于MSCs的增殖［1］。傳代細(xì)胞接種密度多為(3～7)×104/cm2。MSCs向軟骨誘導(dǎo)分化多使用高糖DMED培養(yǎng)基，再添加地塞米松、Vit C以及培養(yǎng)基添加物ITS(insulitransferrinsodium selenite media supplement)等構(gòu)成不完全誘導(dǎo)培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)時(shí)再添加有誘導(dǎo)分化作用的細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）等即可構(gòu)成完全誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

為模擬胚胎時(shí)期軟骨形成的體內(nèi)環(huán)境，越來越多的試驗(yàn)者傾向于應(yīng)用高密度培養(yǎng)或所謂的微球（pellet）方式來重現(xiàn)胚胎發(fā)育過程中的軟骨前體狀態(tài)。目前認(rèn)為，通過離心處理使MSCs聚集成團(tuán)，利于細(xì)胞間的自分泌與旁分泌，更符合軟骨生長(zhǎng)的要求。PITTENGER等［2］采用離心沉淀式培養(yǎng)法刺激MSCs向軟骨細(xì)胞分化。首先通過離心使MSCs細(xì)胞形成小的團(tuán)狀沉淀，然后靜置培養(yǎng)，10～14 d后，細(xì)胞形態(tài)由梭形變?yōu)榉蚀筌浌羌?xì)胞狀，表達(dá)軟骨細(xì)胞的特異分子標(biāo)記物Ⅱ型膠原及胞外基質(zhì)中蛋白聚糖豐富。并且，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，具有軟骨細(xì)胞分子標(biāo)記物的細(xì)胞數(shù)量越來越多。培養(yǎng)3個(gè)月，通過組織學(xué)觀察可見軟骨細(xì)胞樣陷凹。

2 細(xì)胞因子

諸多試驗(yàn)表明，細(xì)胞因子對(duì)體外培養(yǎng)的MSCs有著強(qiáng)大的誘導(dǎo)分化能力，其中尤以TGF超家族成員效能最強(qiáng)。

2.1 TGFβ系列生長(zhǎng)因子

TGFβ系列生長(zhǎng)因子(TGFβ1、β2、β3)是一族具有多種功能的多肽，它們能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)。1998年JOHNSTONE等［3］率先在體外誘導(dǎo)成年哺乳類MSCs分化生成軟骨獲得成功。其培養(yǎng)液的成分為:DMEM液，ITS和Premix(含胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸、亞油酸、牛血清清蛋白、丙酮酸、抗壞血酸磷酸鹽)，細(xì)胞聚集培養(yǎng)時(shí)加入TGFβ1 0.5～10 ng/L。微球細(xì)胞團(tuán)在37 ℃體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2環(huán)境下培養(yǎng)，7 d時(shí)出現(xiàn)Ⅱ型膠原陽性表達(dá)，以后逐漸增強(qiáng)，21 d后形成的聚合物完全類似軟骨的形態(tài)，甲苯胺藍(lán)染色觀察證實(shí)其具有軟骨基質(zhì)的特征，可檢測(cè)到Ⅱ型膠原和Ⅹ型膠原mRNA表達(dá)，而Ⅰ型膠原不表達(dá)，說明MSCs形成的是軟骨組織，并且為終末表型的肥大軟骨細(xì)胞。

WORSTER等［4］在MSCs培養(yǎng)液中加入不同濃度的TGFβ1，結(jié)果表明，經(jīng)5 ng/L TGFβ1處理的MSCsⅡ型膠原mRNA含量是對(duì)照組的1.7倍，Ⅱ型膠原免疫組化染色區(qū)域和強(qiáng)度與TGFβ1的濃度呈量效增長(zhǎng)關(guān)系。在進(jìn)一步的研究中，WORSTER等［5］觀察了MSCs在含TGFβ的單層培養(yǎng)基及含胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFⅠ)的三維纖維條件培養(yǎng)基中的軟骨發(fā)生，結(jié)果顯示，0或5 ng/L的TGFβ作用6 d后，置于0或100 ng/L的IGFⅠ的三維纖維條件培養(yǎng)基中，13 d后行Ⅰ、Ⅱ型膠原原位雜交和免疫組化測(cè)定蛋白多糖及DNA含量。開始4 d中，TGFβ作用的MSCs明顯增殖，形成細(xì)胞集落，蛋白多糖增加2倍;IGFⅠ作用后，包括蛋白多糖和Ⅱ型膠原mRNA等軟骨細(xì)胞功能指標(biāo)顯著增強(qiáng);TGFβ作用后不經(jīng)IGFⅠ作用的細(xì)胞，軟骨生成指標(biāo)表達(dá)減弱，提示MSCs的分化尚不完全，但兩種因子具有協(xié)同作用。

BARRY等［6］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ2和TGFβ3誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞分化的能力強(qiáng)于TGFβ1，并將聚集培養(yǎng)的MSCs向軟骨細(xì)胞分化的過程分成3個(gè)階段：第1階段為誘導(dǎo)分化前6 d，標(biāo)志為纖維調(diào)節(jié)素及軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)表達(dá)的上調(diào);第2階段為分化的第7天左右，標(biāo)志為Ⅱ型膠原和軟骨粘連蛋白的表達(dá)，同時(shí)硫酸軟骨素逐漸增多;第3階段為接下來的14 d，糖胺多糖逐漸累積，最終形成成熟的軟骨細(xì)胞。

2.2 BMP

BMP是TGFβ超家族的成員之一，它具有誘導(dǎo)MSCs轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞或骨細(xì)胞的能力，并與其他生長(zhǎng)因子存在一定的協(xié)同作用。SEKIYA等［7］用BMP6處理MSCs，發(fā)現(xiàn)BMP6能明顯地促進(jìn)細(xì)胞增殖，擴(kuò)大蛋白多糖的染色范圍；培養(yǎng)1周后即檢測(cè)到Ⅱ型前膠原mRNA。加入500 ng/L BMP6， 10 ng/L TGFβ3， 10-7 mol/L地塞米松的成軟骨培養(yǎng)液中培養(yǎng)，微球的總體積增大，質(zhì)量增加10倍，染色顯示蛋白聚糖合成增加，但無地塞米松或TGFβ3時(shí)效果不明顯；微球的體積和蛋白聚糖染色深度增加，說明在微球培養(yǎng)液中加入BMP6，可增強(qiáng)人MSCs的成軟骨分化能力，且BMP6與TGFβ存在協(xié)同作用。COLTER等［8］調(diào)整了JOHNSTONE等［3］的培養(yǎng)液，將DMEM換為高糖DMEM，并加入500 ng/L BMP6，10 ng/L TGFβ3，將人的MSCs離心成微球后培養(yǎng)21 d，與對(duì)照組相比，MSCs更容易分化成軟骨組織，形成的細(xì)胞體積更大，含更多的蛋白聚糖和Ⅱ型膠原。BMP2與BMP9也能協(xié)同誘導(dǎo)骨髓MSCs定向軟骨分化，并能拮抗IL1等炎癥因子對(duì)細(xì)胞分化的抑制作用。

2.3 bFGF

bFGF具有強(qiáng)烈的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，10 ng/L的濃度下可以明顯地促進(jìn)MSCs增殖。同時(shí)，它還能促進(jìn)軟骨基質(zhì)，特別是Ⅱ型膠原的合成，并阻止蛋白聚糖的降解。MARTIN等［10］研究表明，在體積分?jǐn)?shù)0.01胎牛血清基礎(chǔ)上加用bFGF擴(kuò)增的MSCs接種于支架后產(chǎn)生的三維組織均質(zhì)性更高，且有更高的濕質(zhì)量和糖胺多糖含量，干濕質(zhì)量比例、糖胺多糖、膠原含量與骺軟骨含量相似。TSUTSUMI等［11］在體外擴(kuò)增MSCs時(shí)，加入bFGF或不加bFGF，擴(kuò)增后在成軟骨培養(yǎng)液中行微球培養(yǎng)(培養(yǎng)液中無bFGF)4 d后，加入bFGF組微球的表面出現(xiàn)球形軟骨細(xì)胞，并被軟骨特征性的蛋白多糖圍繞，第8天，所有的MSCs變成球形的軟骨細(xì)胞，所有的3～9代MSCs培養(yǎng)16 d后皆形成軟骨樣組織，而不加bFGF組的MSCs成軟骨分化顯著延遲。每一代細(xì)胞，加bFGF組比不加bFGF組的糖胺聚糖(GAG)含量和Ⅱ、Ⅹ型膠原mRNA的含量都高。說明MSCs在體外擴(kuò)增時(shí)加入bFGF，維持了MSCs的成軟骨分化能力。另據(jù)BUTNARIU等［12］報(bào)道，以106/cm2的高密度接種，用無血清培養(yǎng)基加用bFGF(25 μg/L)、地塞米松(0.4 mg/L)等可誘導(dǎo)MSCs分化為軟骨細(xì)胞表型，比例可達(dá)85%～95%。

2.4 催乳素（PRL）

OGUETA等［13］研究了PRL調(diào)節(jié)MSCs生長(zhǎng)和成軟骨分化的作用，結(jié)果表明，PRL促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)蛋白多糖的合成，在與地塞米松聯(lián)合作用時(shí)，表現(xiàn)為細(xì)胞呈柱狀縱向排列的軟骨組織樣結(jié)構(gòu)。

3 支架材料

干細(xì)胞培養(yǎng)的最終目的是要使MSCs再功能化，以構(gòu)建新的組織或器官。優(yōu)良的支架材料不僅能為細(xì)胞聚集提供場(chǎng)所，保證細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)，甚至可以促進(jìn)細(xì)胞信息傳遞，影響細(xì)胞的增殖與分化。應(yīng)用于干細(xì)胞培養(yǎng)中的支架材料應(yīng)具有以下特點(diǎn)［14］:①良好的生物相容性;②多孔的三維立體結(jié)構(gòu)，孔隙率應(yīng)達(dá)到80%以上，各孔相連通，從而具有很大的內(nèi)表面積，利于細(xì)胞的貼附、營養(yǎng)成分的流入及代謝產(chǎn)物排出;③材料逐漸降解、吸收，不影響新生成組織的結(jié)構(gòu)和功能，降解率與細(xì)胞增殖、分泌基質(zhì)的速度基本一致;④具有良好的表面活性，利于細(xì)胞的貼附并為細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分泌基質(zhì)提供良好的微環(huán)境;⑤可被加工成一定形狀，并有一定的機(jī)械強(qiáng)度，使新生的軟骨具有一定的外形，可被固定于關(guān)節(jié)缺損處;⑥關(guān)節(jié)鏡手術(shù)中選擇的載體材料在操作過程中應(yīng)保持液態(tài)，當(dāng)?shù)竭_(dá)受區(qū)時(shí)可轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)，并且在體積上無任何改變。

目前，應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域的支架材料主要分天然基質(zhì)和人工合成基質(zhì)兩大類。天然基質(zhì)成分包括膠原、透明質(zhì)酸、纖維蛋白、殼聚糖、藻酸鹽等，它們可作為MSCs向軟骨分化的載體成分。但存在孔隙率不夠高的問題，材料中間的細(xì)胞難以獲得營養(yǎng)，同時(shí)降解吸收的速率難以控制，缺乏一定的機(jī)械強(qiáng)度，大量獲取困難。人工合成的基質(zhì)有:聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其共聚物。它們?yōu)槎嗫谆蚍蔷幙椑w維網(wǎng)結(jié)構(gòu)，孔徑大于100 μm，中空體積達(dá)90%，可以吸附大量細(xì)胞，保證細(xì)胞與外界物質(zhì)交換，具有可降解性，在數(shù)月至數(shù)年內(nèi)可完全被體內(nèi)組織取代，是MSCs良好載體。但存在著細(xì)胞親水性差，材料的降解時(shí)間和降解速率不易控制，孔隙率、孔徑越大則材料本身機(jī)械強(qiáng)度和可塑性越差的矛盾。此外，材料的降解產(chǎn)物可能對(duì)組織細(xì)胞產(chǎn)生影響，引起無菌性炎癥反應(yīng)［15］。

MAJUMDAR等［16］將擴(kuò)增3代的人MSCs以25×109/L的密度包埋于海藻酸鹽珠中，使用無血清培養(yǎng)基加用100 nmol/L的地塞米松和10 μg/L的TGFβ3培養(yǎng)3周，結(jié)果顯示，Ⅱ型膠原免疫組化反應(yīng)為陽性，Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)量可比未行TGFβ3處理者增加9倍。

將MSCs摻入Ⅰ型膠原凝膠經(jīng)體外培養(yǎng)同樣可以促使MSCs分化生成軟骨。HUANG等［17］將含TGFβ1的膠原凝膠涂在可吸收支架上，與6個(gè)月的兔MSCs復(fù)合，植入兔的皮下、肌肉和骨膜下，培養(yǎng)2周和4周后，骨膜下的支架含大量的軟骨細(xì)胞，說明涂有TGFβ1的支架可防止MSCs遷移，并有促進(jìn)軟骨形成的能力。

NOTH等［18］將密度為1.5×109/L的人MSCs與可降解材料復(fù)合，在無血清含TGFβ1的成軟骨培養(yǎng)液中培養(yǎng)3周，組織切片觀察顯示，有軟骨形態(tài)的細(xì)胞層形成，周圍有蛋白多糖基質(zhì)環(huán)繞，免疫組化分析顯示在細(xì)胞外基質(zhì)中有Ⅱ型膠原和連接蛋白，RTPCR檢測(cè)到軟骨特征的Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ膠原和蛋白聚糖的基因表達(dá)，掃描電鏡觀察可見表面類似緊密的透明軟骨，提示在支架材料上立體構(gòu)建的軟骨細(xì)胞較單層培養(yǎng)軟骨細(xì)胞有更高生理活性，可作為修復(fù)人關(guān)節(jié)軟骨缺損的初始模型。

4 物理因素

應(yīng)力刺激是軟骨發(fā)育過程中的重要條件。而靜止的軟骨培養(yǎng)條件缺乏必要的應(yīng)力刺激，與體內(nèi)的動(dòng)態(tài)條件相差甚遠(yuǎn)。呂昌偉等［19］將MSCs在三維培養(yǎng)狀態(tài)下分為兩組，實(shí)驗(yàn)組給予0.2 Hz周期性流體應(yīng)力刺激，于轉(zhuǎn)壁生物反應(yīng)器中培養(yǎng)；對(duì)照組靜止培養(yǎng)，兩組均于相同條件培養(yǎng)基內(nèi)誘導(dǎo)軟骨組織形成。2周后實(shí)驗(yàn)組表達(dá)更高水平的Ⅱ型膠原和蛋白多糖，細(xì)胞活力明顯高于對(duì)照組。表明周期性流體應(yīng)力刺激可以明顯促進(jìn)MSCs向軟骨細(xì)胞表型分化，轉(zhuǎn)壁生物反應(yīng)器培養(yǎng)方式明顯優(yōu)于常規(guī)的靜止培養(yǎng)體系。正常應(yīng)力條件下的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了應(yīng)力環(huán)境對(duì)MSCs向軟骨分化具有誘導(dǎo)作用。王剛等［20］將15只日本大耳白兔制成髕骨外側(cè)脫位動(dòng)物模型，以兔MSCs為種子細(xì)胞構(gòu)建自體組織工程移植物修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，術(shù)后6周，移植物正常應(yīng)力組修復(fù)組織淺層為軟骨組織，甲苯胺藍(lán)染色接近正常關(guān)節(jié)軟骨;深層為軟骨下骨，與正常關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)相似；移植物脫位組為骨組織所修復(fù)，缺損周圍的正常關(guān)節(jié)軟骨變薄，軟骨下血管侵入正常關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)。提示在正常應(yīng)力條件下，修復(fù)組織淺層的MSCs向成軟骨細(xì)胞系轉(zhuǎn)化，深層的則向成骨細(xì)胞系轉(zhuǎn)化，異常應(yīng)力使修復(fù)組織淺層及深層的MSCs均向成骨細(xì)胞系轉(zhuǎn)化。說明MSCs在體內(nèi)向軟骨細(xì)胞的分化與應(yīng)力環(huán)境密切相關(guān)，只有在正常應(yīng)力狀態(tài)下修復(fù)效果最佳。

關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境是一種低氧的環(huán)境，在體外常規(guī)培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)良好的細(xì)胞到關(guān)節(jié)腔內(nèi)未必能良好適應(yīng)。MOUSSAVIHARAMI等［21］通過觀察體積分?jǐn)?shù)0.21、0.05兩種氧分壓下的軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在體積分?jǐn)?shù)0.21氧分壓下的軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖受到嚴(yán)重的削弱，并且氧化產(chǎn)物大量堆積，從而認(rèn)為這兩類細(xì)胞已適應(yīng)體內(nèi)的低氧壓環(huán)境，過高的氧分壓對(duì)此類細(xì)胞的培養(yǎng)會(huì)產(chǎn)生不利影響。

5 問題與展望

除上述影響MSCs向軟骨細(xì)胞分化的因素外，體內(nèi)是否還有更有效的軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化因子存在；MSCs向軟骨分化的關(guān)鍵外部刺激信號(hào)及信號(hào)傳導(dǎo)途徑是什么；MSCs的軟骨細(xì)胞表型維持需要什么樣的條件；MSCs經(jīng)體外誘導(dǎo)分化構(gòu)建的軟骨細(xì)胞移植物對(duì)關(guān)節(jié)腔內(nèi)惡劣的高壓、高張力、低氧分壓等理化環(huán)境的適應(yīng)如何；以及支架材料的制備等問題，是目前研究的熱點(diǎn)問題。隨著基因工程、材料工程等技術(shù)向細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的滲透與交叉，MSCs研究將不斷深入，相信在不久的將來它有可能成為臨床醫(yī)生修復(fù)軟骨損傷的得力工具。

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篇7

【摘要】 目的：探討羊藿苷對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。方法：采用差速貼壁法體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀鑒定表面標(biāo)志。取第3代細(xì)胞加入106 mol/L羊藿苷培養(yǎng)基，對(duì)照組僅加入等量普通培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。通過鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)志，堿性磷酸酶試劑盒測(cè)定誘導(dǎo)細(xì)胞堿性磷酸酶活性，組織化學(xué)染色觀察鈣化結(jié)節(jié)形成能力。結(jié)果：體外培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CD105、CD166。羊藿苷誘導(dǎo)組細(xì)胞堿性磷酸酶呈陽性反應(yīng)并有鈣化結(jié)節(jié)形成，而對(duì)照組未見鈣化結(jié)節(jié)形成。結(jié)論：羊藿苷能夠誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，可視為一種良好的骨誘導(dǎo)活性因子。

【關(guān)鍵詞】 羊藿苷;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;成骨分化

[ABSTRACT] Objective: To study the effects of icariin on osteogenic differentiation of rat BMSCs.Methods: Rat BMSCs were isolated and cultured in vitro. At the third passage， rat BMSCs were treated with 106mol/L icariin medium. BMSCs in the control group were treated with an equal volume of medium. Cells were identified by flow cytometry.Alkaline phosphatase were detected by alkaline phosphatase kit， and Calcified nodules were observed using immunohistochemistry staining. Results: Flow cytometry analysis showed that BMSCs cultured in vitro expressed mesenchymal cell marker，including the positive expression of CD29、CD44、CD105 and CD166. The staining of the alkaline phosphatase and calcified nodules were positive after osteoinduction， but calcified nodules were not found in rat BMSCs in the control group.Conclusion: Icariin can induce osteogenic differentiation of rat BMSCs and can be used as an osteoinductive factor.

[KEY WORDS] Icariin; Bone marrow mysenchymal stem cells; Osteogenic differentiation

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs) 是骨髓造血微環(huán)境中的一種重要細(xì)胞成分，具有多向分化潛能，在一定的誘導(dǎo)條件下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等[1]，在組織工程和細(xì)胞治療等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。羊藿是中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松的常用藥物，而羊藿苷是發(fā)揮藥理活性的主要物質(zhì) [2]，大量研究[310]證實(shí)羊藿苷能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的增殖與分化，但有關(guān)羊藿苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用報(bào)道甚少。本研究通過體外分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，探討羊藿苷對(duì)其向成骨細(xì)胞分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器

選取2月齡清潔級(jí)SD大鼠，體重180～200 g，購于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 胎牛血清(Hyclone公司)、LDMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)、二甲基亞砜(DMSO Sigma公司)、羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)、四甲基偶氮唑鹽(Sigma公司)、堿性磷酸酶試劑盒(ALP)、CO2培養(yǎng)箱(Forma公司)、倒置顯微鏡(Olympus公司)、超速離心機(jī)(Sigma公司)、流式細(xì)胞儀(美國BD公司 Ver3.0)、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Sysmex公司 F820)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠BMSCs體外分離、擴(kuò)增、純化 無菌條件下取大鼠股骨、脛骨，用含抗凝劑的無血清LDMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，移入離心管，加入適量PBS緩沖液，1 500 rpm離心10 min，棄上清液及脂肪層，再重復(fù)離心1次。重懸細(xì)胞沉淀，加入含10%FBS的LDMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，按1×106/mL接種，置于37 ℃、飽和濕度的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，3 d后半量換液，5 d全量換液，棄掉未貼壁細(xì)胞，以后每2～3 d換液1次，7～9 d左右細(xì)胞達(dá)80%融合，用0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化1 min，加入含血清培養(yǎng)基終止消化，1 500 rpm離心，棄上清后重懸細(xì)胞，按1∶3接種傳代。每日倒置顯微鏡下觀察原代及傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況及形態(tài)特征。

1.2.2 大鼠BMSCs流式細(xì)胞儀鑒定 取P3代細(xì)胞近80%融合后吸掉培養(yǎng)液，0.25 %胰酶室溫消化2 min，吹打成單細(xì)胞懸液，PBS洗3次，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原表達(dá)。

1.2.3 羊藿苷對(duì)BMSCs成骨分化的影響 取P3代細(xì)胞以1×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h細(xì)胞完全貼壁吸去原培養(yǎng)基，對(duì)照組繼續(xù)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，羊藿苷用基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)液加羊藿苷10～6 mol/L，每隔2～3 d換液。

1.2.4 堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第5天采用重氮鹽法(改良Kaplow法)染色，可見胞漿有藍(lán)染顆?；驂K狀沉淀，為ALP陽性反應(yīng)。

1.2.5 鈣化結(jié)節(jié)免疫組化染色 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第15天采用VonKossa法進(jìn)行鈣化結(jié)節(jié)的組織化學(xué)染色。PBS沖洗2次，95%乙醇固定10 min，蒸餾水沖洗3次。加2 g/dL硝酸銀置暗處1 h。蒸餾水沖洗3次，再用流水沖洗10 min，5 g/dL硫代硫酸鈉還原1 h，干燥封片。鈣化結(jié)節(jié)呈黑色。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs形態(tài)學(xué)特征

原代細(xì)胞24 h部分開始貼壁，呈透亮圓形;48 h可見大量圓形細(xì)胞貼壁，部分細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)梭形;5 d可見貼壁細(xì)胞呈單個(gè)分散或成簇生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)均勻，多呈長(zhǎng)梭形、紡錘形;培養(yǎng)至7～9 d細(xì)胞達(dá)80%～90%融合。傳代細(xì)胞12 h內(nèi)完全貼壁，48 h后進(jìn)入增殖期，4～5 d細(xì)胞達(dá)到完全融合，排列呈現(xiàn)旋渦狀，未見細(xì)胞接觸抑制。

2.2 大鼠BMSCs流式細(xì)胞儀鑒定

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示CD29、CD44、CD105、CD166表達(dá)陽性，CD34、CD80、CD86陰性，BMSCs均一性好，純度達(dá)97%以上。

2.3 羊藿苷組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征

BMSCs由梭形或紡錘形變成多邊形或方形等多種形態(tài)，細(xì)胞重疊，細(xì)胞之間界限模糊，逐漸形成了多個(gè)散在的細(xì)胞結(jié)節(jié)，胞質(zhì)中出現(xiàn)鈣鹽結(jié)晶體。

2.4 ALP染色

羊藿苷組細(xì)胞的胞漿中可見棕黃色的細(xì)小顆粒，ALP染色陽性，在細(xì)胞密集區(qū)反應(yīng)強(qiáng)烈;對(duì)照組細(xì)胞仍為梭形，ALP染色呈陰性。

2.5 Von Kossa染色

蘇木素復(fù)染可見羊藿苷組細(xì)胞胞漿呈棕黑色，內(nèi)有大量棕黑色細(xì)小均勻顆粒，細(xì)胞表現(xiàn)明顯成骨活性。

3 討論

早在1976年Fridedenstein等[11]研究發(fā)現(xiàn)骨髓中存在一類具有多向分化潛能的細(xì)胞，在不同條件下可被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等，稱之為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。由于其具有成骨分化能力，免疫原性較弱[12]，且獲取相對(duì)容易。因此，被認(rèn)為是目前骨組織工程種子細(xì)胞的重要來源，具有廣闊的應(yīng)用前景。BMSCs是一群具有獨(dú)特表型的細(xì)胞，它表達(dá)多種表面標(biāo)記物，包括粘附分子、生長(zhǎng)因子、整和素和細(xì)胞因子及其受體等。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：CD29、CD44、CD105、CD166表達(dá)陽性，CD34、CD80、CD86陰性。本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果與Pittenger等[13]報(bào)道的BMSCs表面標(biāo)志CD29、CD44、CD166、CD105等陽性，不表達(dá)CD34、CD45、CD14等相似，證明所分離培養(yǎng)的細(xì)胞確為BMSCs。

羊藿苷是傳統(tǒng)中藥羊藿的有效藥理成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、影響內(nèi)分泌和心血管系統(tǒng)等多種重要的生物活性。近年來已被廣泛用于抗骨質(zhì)疏松治療和成骨、破骨細(xì)胞研究。本研究發(fā)現(xiàn)羊藿苷誘導(dǎo)后BMSCs細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變，由原來的梭形變成多邊形或方形，與成骨細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)特點(diǎn)相似。ALP被認(rèn)為是BMSCs的早期成骨分化指標(biāo)，5 d時(shí)檢測(cè)羊藿苷組細(xì)胞ALP表達(dá)呈陽性，而對(duì)照組表達(dá)陰性，證明羊藿苷具有成骨誘導(dǎo)活性。15 d后，可見細(xì)胞外鈣鹽沉積，部分細(xì)胞呈聚集樣生長(zhǎng)，在聚集生長(zhǎng)的中心可見鈣化結(jié)節(jié)，而鈣化結(jié)節(jié)是成骨細(xì)胞功能活動(dòng)的表現(xiàn)形式;對(duì)照組細(xì)胞則未見鈣化結(jié)節(jié)形成，細(xì)胞亦無聚集生長(zhǎng)趨勢(shì)。綜合以上結(jié)果，羊藿苷可通過誘導(dǎo)堿性磷酸酶和鈣化結(jié)節(jié)形成促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，可視為一種良好的骨誘導(dǎo)活性因子。

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11 Friedenstein AJ， Gorskaja JF， Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs[J]. Exp Hematol，1976，4(5):267274.

篇8

關(guān)鍵詞:細(xì)胞分化 基因選擇性表達(dá) 基因表達(dá)調(diào)控

一、細(xì)胞分化

多細(xì)胞生物的個(gè)體發(fā)育是指從受精卵發(fā)育成為性成熟個(gè)體的過程。在該過程中,受精卵的分裂是有絲分裂,產(chǎn)生的是一個(gè)克隆的細(xì)胞,那機(jī)體又如何形成不同的組織和器官呢?說明在個(gè)體發(fā)育過程中,除了細(xì)胞分裂還有一個(gè)更重要的事件,那就是細(xì)胞分化。細(xì)胞分化是在個(gè)體發(fā)育過程中,由一種相同的細(xì)胞類型經(jīng)過細(xì)胞分裂后逐漸在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上形成穩(wěn)定差異的過程?？梢?生物在個(gè)體發(fā)育過程中,通過細(xì)胞分裂增加細(xì)胞的數(shù)目,通過細(xì)胞分化增加細(xì)胞的種類,形成不同的組織器官,最終形成生命有機(jī)體。

細(xì)胞分化遵循以下特點(diǎn):第一,分化細(xì)胞來自共同的母細(xì)胞――受精卵;第二,在個(gè)體發(fā)育中,細(xì)胞分化是不可逆的,一旦分化啟動(dòng),即使誘導(dǎo)分化的因子不存在時(shí),分化也繼續(xù)進(jìn)行,而且是穩(wěn)定的;第三,對(duì)于大多數(shù)生物種類來說,雖然形態(tài)各異,功能不同,但仍保持全部基因組;第四,細(xì)胞的分化是有限的活動(dòng),不是無限的,在幾百萬億個(gè)細(xì)胞組成的有機(jī)體中,只有幾百種類型的細(xì)胞構(gòu)成若干組織和器官。

Southern雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí),一個(gè)生物機(jī)體中不同種類的分化細(xì)胞具有共同的基因組。Northern雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí),同一生物機(jī)體中不同種類的分化細(xì)胞中只表達(dá)其中一小部分遺傳信息,即每種類型的細(xì)胞只選擇性表達(dá)特定的基因,產(chǎn)生每一類型細(xì)胞特有的一套蛋白質(zhì),從而使其在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上區(qū)別于其它細(xì)胞?？梢娂?xì)胞分化的直接原因是在細(xì)胞中產(chǎn)生了不同于其它細(xì)胞的特異性蛋白質(zhì),細(xì)胞分化的實(shí)質(zhì)是基因的選擇性表達(dá)。

分化細(xì)胞基因組中所表達(dá)的基因大致可分為兩種基本類型:一類是管家基因(house-keeping genes,),是所有細(xì)胞中均表達(dá)的一類基因,產(chǎn)物是維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)所必須的。如微管蛋白基因、組蛋白基因、核糖體蛋白基因等。另一類是組織特異性基因(tissue-specific genes,)是指不同類型細(xì)胞異性表達(dá)的基因,產(chǎn)物賦予各種類型細(xì)胞特異的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征與功能。如輸卵管細(xì)胞特異表達(dá)的卵清蛋白基因、胰島B細(xì)胞特異表達(dá)的胰島素基因等。因此可以說,細(xì)胞分化的實(shí)質(zhì)是組織特異性基因在時(shí)間與空間上的差異性表達(dá)。

二、分化細(xì)胞的基因選擇性表達(dá)

分化細(xì)胞是如何從它的基因組中篩選出所要表達(dá)的基因呢?或者說它是如何關(guān)閉它所不表達(dá)的基因?可能的選擇方式有以下幾種:

1.基因失活

基因失活是個(gè)體發(fā)育過程中獨(dú)特的調(diào)節(jié)機(jī)制。是指在某些細(xì)胞類型或一定的發(fā)育階段,原來的常染色質(zhì)聚縮,并喪失基因轉(zhuǎn)錄活性,變?yōu)楫惾旧|(zhì)。這種兼性異染色質(zhì)在胚胎細(xì)胞中很少,而高度分化的細(xì)胞中含量較多,說明隨細(xì)胞的分化,較多的基因漸次以聚縮狀態(tài)而關(guān)閉。如雌性胎生哺乳動(dòng)物細(xì)胞中兩條X染色體之一在發(fā)育早期隨機(jī)失活,以確保與只有一條X染色體的雄性個(gè)體細(xì)胞內(nèi)的X染色體基因的劑量相同。一旦發(fā)生X染色體失活,這個(gè)信息便能穩(wěn)定地傳遞給子代細(xì)胞,使該細(xì)胞有絲分裂所產(chǎn)生的后代細(xì)胞都保持同一條X染色體失活。因?yàn)槿说腦染色體上有1.28億個(gè)堿基對(duì),包含1465個(gè)基因,所以X染色體的失活是永久性關(guān)閉基因的一種措施。

2.基因丟失

基因丟失是在細(xì)胞分化時(shí),清除某個(gè)基因活性的方式之一。如馬蛔蟲的受精卵細(xì)胞內(nèi)只有一對(duì)染色體(2n=2),這對(duì)染色體上排列著許多著絲點(diǎn)。在由受精卵發(fā)育為成體的早期階段只有一個(gè)著絲點(diǎn)行使功能,保證了有絲分裂的正常進(jìn)行。當(dāng)個(gè)體發(fā)育到一定階段后,在將來分化產(chǎn)生體細(xì)胞的細(xì)胞中,這對(duì)染色體斷裂形成許多小的染色體,其有的含有著絲點(diǎn)的小片段,在以后的細(xì)胞分裂中都將保持下去。那些不含有著絲點(diǎn)的染色體片段因不能在細(xì)胞分裂中正常分配而丟失。在將來形成生殖細(xì)胞的細(xì)胞中,不存在染色體丟失的情況。

3.基因擴(kuò)增

基因擴(kuò)增是指某些基因的拷貝數(shù)專一性大量增加的過程,它使細(xì)胞在短期內(nèi)產(chǎn)生大量的基因產(chǎn)物以滿足生長(zhǎng)發(fā)育的需要,是基因活性調(diào)節(jié)的一種方式。如非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中原有rRNA基因約500個(gè)拷貝,在減數(shù)分裂期Ⅰ的粗線期,這個(gè)基因開始迅速復(fù)制,到雙線期其拷貝數(shù)約200萬個(gè),擴(kuò)增了4000倍,可用于合成1012個(gè)核糖體,以滿足卵裂期和胚胎期合成大量蛋白質(zhì)的需要。

4.基因重排

是某些基因片段改變?cè)瓉泶嬖陧樞?通過調(diào)整有關(guān)基因片段的銜接順序,重排為一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄單位,是增加基因編碼產(chǎn)物種類的一種措施,也是調(diào)節(jié)基因活性的一種方式。如B淋巴細(xì)胞成熟過程中免疫球蛋白結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)就是經(jīng)過多次重排而實(shí)現(xiàn)的。免疫球蛋白的肽鏈主要由可變區(qū)(V區(qū))、恒定區(qū)(C區(qū))以及兩者之間的連接區(qū)(J區(qū)和D區(qū))組成,V、C、J和D基因片段均有多個(gè),而且在胚胎細(xì)胞中相隔較遠(yuǎn)。編碼產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞發(fā)育分化時(shí),通過染色體內(nèi)DN段的重排把4個(gè)相隔較遠(yuǎn)的基因片段連在一起,從而產(chǎn)生了具有表達(dá)活性的免疫球蛋白基因。在重排過程中,四種基因的組合類型不同,所形成的免疫球蛋白的基因就不同,從而使機(jī)體可以表達(dá)出多達(dá)1011種免疫球蛋白。

三、基因選擇性表達(dá)的調(diào)控

1.組合調(diào)控引發(fā)組織特異性基因的表達(dá)

組合調(diào)控理論認(rèn)為,在一個(gè)生物體中,啟動(dòng)為數(shù)眾多的特異細(xì)胞類型分化程序的是有限的少量蛋白質(zhì),即調(diào)控一個(gè)生物體中細(xì)胞分化的蛋白質(zhì)的種類是一定的,只是這些蛋白質(zhì)的組合方式不同,就啟動(dòng)了不同類型細(xì)胞的分化。這樣,如果調(diào)控蛋白的數(shù)目為n,則其調(diào)控的組合在理論上可以啟動(dòng)分化的細(xì)胞類型為2n。在啟動(dòng)細(xì)胞分化的各類調(diào)控蛋白中,往往存在一兩種起決定作用的蛋白質(zhì),有時(shí)單一調(diào)控蛋白表達(dá)就有可能啟動(dòng)整個(gè)細(xì)胞的分化過程。如MyoD是一種在成肌細(xì)胞分化為骨骼肌細(xì)胞過程中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。如將其轉(zhuǎn)移到體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中表達(dá),結(jié)果使來自皮膚結(jié)締組織的成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出骨骼肌細(xì)胞的特征。顯然,在成纖維細(xì)胞中已經(jīng)具備了肌細(xì)胞特異性基因表達(dá)所需要的其他必要的調(diào)控蛋白,一旦加入MyoD后,即形成了啟動(dòng)肌細(xì)胞分化的特異性調(diào)控蛋白組合。

2.基因活性的調(diào)控

(1)基因組DNA的甲基化和去甲基化與基因活性調(diào)控DNA甲基化修飾現(xiàn)象廣泛存在于多種有機(jī)體中

研究表明,DNA的甲基化過程不但與DNA的復(fù)制起始及錯(cuò)誤修正時(shí)的定位有關(guān),還可通過改變基因的表達(dá)參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和發(fā)育過程的調(diào)控?；蚪MDNA的甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供甲基基團(tuán),在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA-MTs)的作用下,將基因組DNA序列中CpG二核苷酸的胞嘧啶甲基化為5―甲基化胞嘧啶的一種反應(yīng)。甲基化修飾是基因組后天修飾的重要機(jī)制之一。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變,從而調(diào)控基因表達(dá)。甲基化導(dǎo)致某些區(qū)域DNA構(gòu)象變化,抑制了轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)區(qū)DNA的結(jié)合效率,抑制基因表達(dá)。研究表明,啟動(dòng)區(qū)DNA分子上甲基化的密度與基因轉(zhuǎn)錄受抑制的程度密切相關(guān)。有些研究還表明,成體干細(xì)胞的分化過程中至少部分的通過多余基因的沉默來抑制不和諧表型的表達(dá),而甲基化很可能是基因選擇性表達(dá)的重要調(diào)控機(jī)制,以維持干細(xì)胞的定向分化。相反,甲基化程度的降低或去甲基化可使基因表達(dá)活性提高?？梢?細(xì)胞分化過程中,在不同時(shí)空進(jìn)行有序的DNA甲基化和去甲基化是基因選擇性表達(dá)的有效調(diào)節(jié)方式。

(2)組蛋白的乙?；叭ヒ阴；瘜?duì)基因活性的調(diào)控

構(gòu)成染色質(zhì)的核心組蛋白的N端部分可被組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase HAT)和組蛋白去乙酰基酶(histone deacetylase HDAC)修飾,加上或去掉乙?；鶊F(tuán)。組蛋白N端的賴氨酸殘基的乙?；泻土私M蛋白尾巴的正電荷,降低了與DNA的親和力,導(dǎo)致核小體構(gòu)象發(fā)生有利于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白與染色質(zhì)相結(jié)合的變化,從而提高了基因的轉(zhuǎn)錄活性。研究發(fā)現(xiàn),受乙酰化修飾的組蛋白形成的核小體的結(jié)構(gòu)比未經(jīng)修飾的組蛋白形成的核小體松散。實(shí)驗(yàn)證明,HAT并不是染色質(zhì)結(jié)合蛋白,但可以通過與其他蛋白質(zhì)相互作用來影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。許多轉(zhuǎn)錄激活因子如通用轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物中的一些亞基、與激素受體協(xié)同作用的轉(zhuǎn)錄共激活子ACTR都具有乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性。哺乳動(dòng)物和酵母中得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都表明,轉(zhuǎn)錄抑制主要是由于新產(chǎn)生的組蛋白去乙?；?HDAC)/酵母去乙酰化酶(Rpd3)形成的復(fù)合物專一性結(jié)合于某個(gè)或某類基因啟動(dòng)子區(qū)附近的組蛋白位點(diǎn)并使之去乙?；?導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生不利于基因轉(zhuǎn)錄的變化。

綜上所述,細(xì)胞生命活動(dòng)過程中的基因表達(dá)是受基因中的調(diào)控元件和相應(yīng)的蛋白質(zhì)因子相互作用來實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。細(xì)胞分化過程中的基因選擇性表達(dá)是通過改變或修飾基因中的調(diào)控元件,改變其與蛋白質(zhì)因子的相互作用,達(dá)到抑制或激活某些基因表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)基因的選擇性表達(dá)。

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篇9

關(guān)鍵詞：神經(jīng)細(xì)胞分化；銅離子； 突觸形成； N2a細(xì)胞

1 引言

作為生物體最復(fù)雜的系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)負(fù)責(zé)生物體各種信息的傳遞。神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞通過神經(jīng)突觸釋放神經(jīng)遞質(zhì)而實(shí)現(xiàn)。研究突觸的形成和調(diào)節(jié)機(jī)制，是理解神經(jīng)系統(tǒng)各種工作機(jī)制的基礎(chǔ)。研究學(xué)習(xí)、記憶的過程，其實(shí)就是研究學(xué)習(xí)、記憶中相關(guān)神經(jīng)突觸形成和調(diào)節(jié)的過程[1～3]。重大神經(jīng)退行性疾病如老年癡呆癥、帕金森綜合癥等疾病也已被證明與神經(jīng)突觸的非正常損傷、退化密切相關(guān)，研究突觸的形成和調(diào)節(jié)機(jī)制，是治療這些疾病的前提和依據(jù)[4～7]。

銅是細(xì)胞生長(zhǎng)的一種必須的微量元素，它以輔基的形式參與細(xì)胞內(nèi)的多種代謝途徑。細(xì)胞內(nèi)銅離子的變化具有廣泛的影響，細(xì)胞內(nèi)銅離子的濃度過低會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)一些酶的活性及相應(yīng)的生理代謝途徑進(jìn)而影響細(xì)胞的正常功能和存活。據(jù)相關(guān)研究顯示，成年人體內(nèi)銅離子總量約為100～150 mg，嬰幼兒每天銅攝入量約為0.4～1.0 mg，成年人每天銅攝入量約為1.5～3 mg，血清銅的正常值約10～20 μmol/L，在腦脊液中濃度更低。雖然是生理上必須的金屬離子，但當(dāng)銅離子的濃度超過生理需求時(shí)亦會(huì)引起嚴(yán)重的問題[8～10]。

為了探索銅離子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)分化的具體影響，實(shí)驗(yàn)選用小鼠的神經(jīng)瘤細(xì)胞（N2a細(xì)胞）作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在其生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中加入不同濃度的銅離子，通過對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的細(xì)胞進(jìn)行成像，測(cè)算細(xì)胞分化率、分支數(shù)和分支長(zhǎng)并對(duì)測(cè)算結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除銅離子在較低濃度下對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化并無特別顯著的影響，顯示神經(jīng)細(xì)胞對(duì)低濃度的銅離子具有一定的耐受能力。

2 材料與方法

2.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用N2a細(xì)胞，均系武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院周嚴(yán)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送，并于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，約每36～48 h傳代一次。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞培養(yǎng)所用的恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱系由美國Thermo Fisher公司生產(chǎn)，細(xì)胞傳代及轉(zhuǎn)染所用的超凈工作臺(tái)由蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)，離心機(jī)由美國Thermo Fisher公司生產(chǎn)，恒溫水浴鍋由鞏義市予華儀器有限公司生產(chǎn)，渦旋振蕩器由其林貝爾儀器制造有限公司，免疫熒光共聚焦顯微鏡（Nikon Texas eclipse Ti）由日本尼康株式會(huì)社生產(chǎn)。

實(shí)驗(yàn)所需生化試劑均由美國Gibco公司生產(chǎn)，所有無機(jī)試劑均由美國Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)。

2.3 方法

2.3.1 實(shí)驗(yàn)溶液配制

利用胎牛血清、DMEM等試劑配制實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞培養(yǎng)基及相關(guān)緩沖液。所有溶液均需調(diào)整pH值及滲透壓至適宜細(xì)胞生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的值，并除菌。配置四個(gè)濃度梯度的氯化銅溶液，使銅離子工作濃度分別為0.0002 mg/mL、0.001 mg/mL、0.005 mg/mL、0.02 mg/mL。

2.3.2 細(xì)胞傳代，準(zhǔn)備生長(zhǎng)密度合適的N2a細(xì)胞

以T25培養(yǎng)瓶為容器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以80%的覆蓋率作為細(xì)胞是否傳代的臨界點(diǎn)，當(dāng)細(xì)胞的覆蓋率大于80%時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，先清除培養(yǎng)基，之后取2 mL PBS緩沖液輕柔地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗，以清洗細(xì)胞生長(zhǎng)過程中的各種分泌物和殘留的培養(yǎng)基，上述工作重復(fù)2次。之后加入1 mL 0.05%的胰蛋白酶-EDTA溶液，放入二氧化碳培B箱消化約2 min，當(dāng)輕搖培養(yǎng)瓶可見細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上滑落即可停止消化。加入3倍體積的細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，并輕輕將尚未從培養(yǎng)瓶壁上脫落的細(xì)胞吹打下來。將上述細(xì)胞懸濁液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，以300～400 g離心2 min。去除離心后的上清液后加入新的培養(yǎng)基輕柔地將細(xì)胞重懸，按比例種植到6孔板中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3.3 加入不同濃度的銅離子溶液并經(jīng)行細(xì)胞成像

在移植約12 h后，細(xì)胞密度基本保持50%～80%，分別在6孔板中設(shè)置空白對(duì)照組，0.0002 mg/mL、0.001 mg/mL、0.005 mg/mL、0.02 mg/mL四個(gè)濃度梯度的銅離子加藥組，及兩個(gè)備用組。分別在加入不同濃度梯度銅離子后的24 h、48 h對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行成像。

2.3.4 數(shù)據(jù)的采集與處理

統(tǒng)計(jì)各組神經(jīng)細(xì)胞的分化率和分支長(zhǎng)，利用Image J （National Institutes of Health）采集神經(jīng)細(xì)胞的分支長(zhǎng)，將突起總長(zhǎng)度大于細(xì)胞胞體直徑2倍的細(xì)胞視作分化細(xì)胞。以上所得數(shù)據(jù)以隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方式，用SPSS Statistic 23 （IBM Corporation）進(jìn)行t檢驗(yàn)，利用GraphPad Prism 6 （GraphPad Software， Inc）及Adobe Illustrator CC （Adobe Corporation）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖繪制。

3 結(jié)果

3.1 加入Cu2+24 h后對(duì)N2a細(xì)胞生長(zhǎng)分化的影響

根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，Cu2+是人體所需的元素之一，但當(dāng)其含量過高亦會(huì)產(chǎn)生不良影響。為探究Cu2+對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)分化的影響，選取N2a細(xì)胞作為研究對(duì)象，培養(yǎng)約12 h后使細(xì)胞密度基本保持50%～80%，加入Cu2+濃度分別為0.0002 mg/mL、0.001 mg/mL、0.005 mg/mL、0.02 mg/mL的CuCl2溶液。分別在培養(yǎng)24 h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像，采集細(xì)胞的分化率和分支數(shù)，并以Image J軟件測(cè)量細(xì)胞的分支長(zhǎng)，依照隨機(jī)區(qū)組方式進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，在對(duì)三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（圖1）。

在N2a胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中加入梯度濃度的CuCl2溶液，培養(yǎng)24 h后對(duì)細(xì)胞成像發(fā)現(xiàn)，濃度為0.02 mg/mL 的Cu2+使細(xì)胞的分支長(zhǎng)略有減少。除此之外，梯度濃度的Cu2+對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化并未產(chǎn)生顯著影響。0.02 mg/mL的Cu2+濃度已經(jīng)遠(yuǎn)超過血清中正常的Cu2+濃度，因此過高濃度的Cu2+對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的分化呈抑制作用。

3.2 加入Cu2+48 h后對(duì)N2a細(xì)胞生長(zhǎng)分化的影響

高濃度的Cu2+作用于神經(jīng)細(xì)胞24 h即對(duì)分化產(chǎn)生一定的抑制作用，為繼續(xù)研究更長(zhǎng)時(shí)間的Cu2+作用對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響，加入Cu2+濃度分別為0.0002 mg/mL、0.001 mg/mL、0.005 mg/mL、0.02 mg/mL的CuCl2溶液48 h后，分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像，采集細(xì)胞的分化率和分支數(shù)，并以Image J軟件測(cè)量細(xì)胞的分支長(zhǎng)，依照隨機(jī)區(qū)組方式進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，再對(duì)三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（圖2）。

在N2a細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中加入梯度濃度的CuCl2溶液，培養(yǎng)48 h后對(duì)細(xì)胞成像發(fā)現(xiàn)，梯度濃度的Cu2+對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的分化率、分支數(shù)和分支長(zhǎng)均無顯著影響。這一結(jié)果說明Cu2+雖然對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的分化有一定的抑制作用，但這個(gè)作用主要存在于分化的早期，隨著分化時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)細(xì)胞仍能達(dá)到正常的分化水平。

4 討論

作為神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)功能的重要事件，神經(jīng)細(xì)胞分化是受眾多因素影響的復(fù)雜過程，同時(shí)也是神經(jīng)科學(xué)需要研究和闡明的重要問題。細(xì)胞內(nèi)的多種代謝途徑中，銅離子以輔基的形式存在其中，其濃度可以影響正常生理功能的維持。銅離子是人體所必須的金屬離子之一，此次研究重點(diǎn)探討了銅離子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞分化的影響。

研究選擇N2a細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料。N2a細(xì)胞，即mouse neuroblastoma N2a cells，別名Neuro-2a，是由Klebe和Ruddle經(jīng)A株白鼠的自生腫瘤建立，該細(xì)胞貼壁良好，多數(shù)成神經(jīng)元樣，具有軸突樣結(jié)構(gòu)。N2a細(xì)胞常見易得，且易于培養(yǎng)，在神經(jīng)細(xì)胞的分化神經(jīng)信號(hào)通路的研究中已被大量應(yīng)用[11，12]。

通過在N2a細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中加入梯度濃度的Cu2+離子，通過采集神經(jīng)細(xì)胞分化率、分支數(shù)和分支長(zhǎng)3個(gè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)，來研究不同濃度的Cu2+離子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞分化的影響。對(duì)所采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行通風(fēng)機(jī)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，除在高濃度Cu2+離子（0.02 mg/mL）在加入初期（24 h）對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的分支長(zhǎng)略有抑制作用外，不同梯度濃度的Cu2+離子對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化均無顯著的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，神經(jīng)細(xì)胞對(duì)Cu2+離子具有一定的耐受能力，在相對(duì)較低的濃度下，Cu2+離子不會(huì)影響神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。但是過高濃度的Cu2+會(huì)降低細(xì)胞分化初期的分化能力。

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篇10

干細(xì)胞是一種具有無限自我復(fù)制能力和向多種細(xì)胞分化潛能的細(xì)胞。現(xiàn)在被廣泛研究的有胚胎干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞，前者指早期胚胎的多能于細(xì)胞(pluripotent cell)，后者指存在于骨髓中的具有多向分化潛能和自我更新能力的干細(xì)胞。目前認(rèn)為骨髓中至少含有兩種干細(xì)胞：造血干細(xì)胞(hematopietic stemcell，HSC)和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)。近幾年來將干細(xì)胞定向分化的神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病受到了廣泛的關(guān)注，成為臨床和實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)之一。因此如何將胚胎干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞是研究的關(guān)鍵所在?，F(xiàn)主要就干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞及中藥干預(yù)的研究現(xiàn)況作一綜述。

1　干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的定向分化

1.1　胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化方法 目前胚胎干細(xì)胞定向分化的方法大致分為以下3類：①體外誘導(dǎo)法，此種方法很多，也是最為常用的，包括維A酸(維甲酸，RA)誘導(dǎo)、基質(zhì)細(xì)胞源性的誘導(dǎo)活性、生長(zhǎng)或分化因子誘導(dǎo)、按譜系限制性發(fā)育控制基因的方向進(jìn)行分化等。其中華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院Bain等[1]的維甲酸4－/4＋誘導(dǎo)法被視為最基本的，也是最經(jīng)典的神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)方法。雖然維甲酸是胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的有效誘導(dǎo)劑，但維甲酸誘導(dǎo)無法排除雜細(xì)胞的存在，且誘導(dǎo)后的神經(jīng)細(xì)胞不能增殖，存活時(shí)間也短[2]。而譜系選擇法誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞可以彌補(bǔ)這些缺陷，它使胚胎干細(xì)胞經(jīng)歷了胚胎干細(xì)胞－類胚體神經(jīng)前體細(xì)胞終末類型細(xì)胞4個(gè)過程，較之維甲酸誘導(dǎo)法可能更接近于胚胎正常發(fā)育過程。因此，在胚胎干細(xì)胞移植研究領(lǐng)域，采用譜系選擇法誘導(dǎo)出神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)行移植將是一種趨勢(shì)[3]。②導(dǎo)人外源性基因，使其分化為某一特定類型的細(xì)胞。③體內(nèi)定向分化，使胚胎干細(xì)胞多數(shù)分化為該組織特異性的細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞移植人體內(nèi)后的遷移方向和分化的細(xì)胞類型受局部微循環(huán)的影響。

為找到胚胎干細(xì)胞定向分化的最佳條件，郭雨霽等[4]將從小鼠胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中獲取的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過向培養(yǎng)液中分別加入維甲酸、大腦皮質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液＋維甲酸、β－巰基乙醇＋維甲酸＋大腦皮質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液，觀察胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用維甲酸、β－巰基乙醇和大腦皮質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液聯(lián)合誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞，可使70％以上的胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)元特異性烯醇化酶免疫陽性的神經(jīng)細(xì)胞。并且認(rèn)為聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化有明顯的互補(bǔ)和協(xié)同作用。

1.2　骨髓干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化方法定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的骨髓干細(xì)胞是指骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSC)，又稱為骨髓基質(zhì)(干)細(xì)胞，簡(jiǎn)稱骨髓干細(xì)胞。BMSC在合適的體外環(huán)境中可長(zhǎng)期生長(zhǎng)，呈成纖維樣細(xì)胞表型，可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等[5，6]。BMSC具有來源廣泛、分離培養(yǎng)容易、多向分化能力、易被外源性基因轉(zhuǎn)染、植入反應(yīng)低及無成瘤性等特點(diǎn)[7]。雖然當(dāng)前分離純化培養(yǎng)BMSC的方法很多，但骨髓細(xì)胞是一群異質(zhì)細(xì)胞，成分復(fù)雜，BMSC缺乏特異標(biāo)記分子。如何進(jìn)一步對(duì)BMSC進(jìn)行分離純化，仍是一個(gè)亟須解決的課題[8]。

BMSC向神經(jīng)細(xì)胞的定向分化研究主要也分體外培養(yǎng)和體內(nèi)分化兩部分。體外實(shí)驗(yàn)主要是在體外培養(yǎng)基中加入抗氧化劑或者生長(zhǎng)因子以誘導(dǎo)分化。如姜曉丹等[9]采用梯度密度離心法分離獲取成人骨髓源細(xì)胞，“CYTOKINE?神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液”培養(yǎng)主要含有細(xì)胞因子：膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)(20ng/mL)、維甲酸(0.5 ug/mL)、LIF(10 ng/mL)等，發(fā)現(xiàn)成人骨髓源細(xì)胞在相應(yīng)培養(yǎng)條件下快速分裂增殖為大而圓并含粗大胞質(zhì)顆粒的神經(jīng)干細(xì)胞。Iblack等[10]。報(bào)道骨髓干細(xì)胞能夠在β－巰基乙醇、二甲基亞砜、3－叔丁基－4羥基茴香醚等抗氧化劑的誘導(dǎo)下分化為神經(jīng)細(xì)胞。施雪英等[11]從大鼠股骨中分離、貼壁法體外擴(kuò)增、傳代培養(yǎng)骨髓干細(xì)胞，以二巰基乙醇(2－ME)預(yù)誘導(dǎo)，再加入2－ME、3－叔丁基－4羥基茴香醚誘導(dǎo)。結(jié)果也證實(shí)2－ME、3－叔丁基－4羥基茴香醚在體外能夠有效的誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。汪泱等[12]將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)后，采用阿魏酸鈉對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿魏酸鈉誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后即可見細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，24 h后表現(xiàn)為典型的神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)，神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物呈陽性表達(dá)。

骨髓干細(xì)胞能夠在體內(nèi)分化為神經(jīng)細(xì)胞，這些細(xì)胞具有廣泛遷移和位置依賴性。目前大多數(shù)體內(nèi)移植的研究都是將分離的骨髓于細(xì)胞直接移植到紋狀體、側(cè)腦室等部位，如Azizi等[13]將BMSC注射到大鼠腦內(nèi)紋狀體區(qū)后，約20％的細(xì)胞成功存活并沿已知的神經(jīng)干細(xì)胞遷移路徑進(jìn)行整合、遷移。

將5溴－2脫氧尿苷(Br－du)標(biāo)記的小鼠BMSC注射到3日齡胎鼠側(cè)腦室，12 d后BMSC遷移到前腦和小腦而未破壞宿主的正常腦結(jié)構(gòu)，部分分化為具有星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、表達(dá)GFAP的細(xì)胞；有些BMSC出現(xiàn)于神經(jīng)元富集的區(qū)域如嗅球和小腦的內(nèi)顆粒層甚至腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并向神經(jīng)元分化[14]。Chen等[15]將Brdu標(biāo)記的大鼠骨髓(BM)細(xì)胞和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BEINF)一起移植到MCAO大鼠的腦缺血邊緣區(qū)，可見Brdu陽性細(xì)胞表達(dá)NeuN和GFAP，腦內(nèi)移植BM＋BDNF組較對(duì)照組運(yùn)動(dòng)和軀體感覺顯著改善。

2　中藥干預(yù)干細(xì)胞定向分化的實(shí)驗(yàn)研究

目前雖然中藥干預(yù)胚胎干細(xì)胞分化的研究尚沒有報(bào)道，但是已有很多中藥干預(yù)神經(jīng)干細(xì)胞分化和骨髓干細(xì)胞定向分化的報(bào)道?，F(xiàn)將目前有關(guān)此方面研究的現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)。

中藥促進(jìn)干細(xì)胞分化的研究分為兩方面：一方面是利用有清熱瀉火、活血化瘀等藥效的單種中藥提取物來體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化，如張艷君等[16]報(bào)道黃芩苷、梔子苷能誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞特異性分化成非成熟神經(jīng)元，而聯(lián)合應(yīng)用補(bǔ)氣中藥提取物黃芪苷、活血化瘀中藥提取物三七總皂苷能明顯提高成熟神經(jīng)元的比例。提出了不同治則中藥針對(duì)損傷后神經(jīng)再生不同階段干預(yù)促進(jìn)神經(jīng)元再生的概念。陳東等[17]發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽在體外

可明顯促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。陳東風(fēng)等[18]采用大腦中動(dòng)脈線拴法造成局灶性腦缺血大鼠模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白(Nestin)的表達(dá)，觀察龜板對(duì)腦缺血后神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白的影響。結(jié)果表明龜板可降低神經(jīng)病評(píng)分和增強(qiáng)腦缺血后Nestin的表達(dá)。提示補(bǔ)腎中藥龜板可減輕神經(jīng)損傷癥狀和對(duì)局灶性腦缺血后神經(jīng)干細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用。沈驊睿等[19]用仙茅水提物對(duì)大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行刺激，經(jīng)RT－PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)、倒置顯微鏡下觀察使用中藥仙茅水提物誘導(dǎo)刺激后的大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的變化情況，結(jié)果RT－PCR檢測(cè)有神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特異性蛋白神經(jīng)元烯醇酶和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)，倒置顯微鏡下觀察到有神經(jīng)元樣細(xì)胞生長(zhǎng)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)有神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞著色。因此認(rèn)為中藥仙茅水提物能定向誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化。并發(fā)現(xiàn)在未加任何誘導(dǎo)藥物的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)照組中也檢測(cè)到有神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和GFAP的mRNA表達(dá)，分析認(rèn)為導(dǎo)致這種未誘導(dǎo)的體外神經(jīng)分化的原因是體外的血清環(huán)境和培養(yǎng)液中的高糖環(huán)境導(dǎo)致的。王勇等[20]利用梯度離心從大鼠骨髓中分離單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，去除不貼壁的細(xì)胞，分離純化，對(duì)其生長(zhǎng)特性進(jìn)行分析。采用含黃芪的無血清L－DMEM誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)分化細(xì)胞中巢蛋白(nestln)、NSE、GFAP的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)黃芪誘導(dǎo)后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，nestln、NSE和GFAP陽性，分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。采用含丹參注射液或硫代甘油誘導(dǎo)BMSC分化為神經(jīng)元，可能與丹參中含有丹參酮、總丹酚酸等多種抗氧化成分有關(guān)[21]。

另一方面是應(yīng)用血清藥理學(xué)原理，利用復(fù)方中藥血清促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化，如楊萍等[22]將不同濃度的肌萎靈注射液加入含5％胎牛血清的DMEM/F12的細(xì)胞培養(yǎng)液中，制成培養(yǎng)液，與用含5％胎牛血清的DMEM/F12稀釋的力如太(終濃度為10 umol/L的培養(yǎng)液)作對(duì)照，觀察二者對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能力。結(jié)果表明肌萎靈注射液和力如太均能能促進(jìn)神經(jīng)于細(xì)胞向神經(jīng)元方向的分化，并且當(dāng)肌萎靈注射液的濃度為1％時(shí)，其誘導(dǎo)能力最強(qiáng)。肌萎靈注射液與力如太相比較也有顯著性的差異。劉伯炎等[23]觀察了中藥腦溢安顆粒對(duì)腦出血后神經(jīng)干細(xì)胞反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)腦出血后nestin陽性細(xì)胞增多，1 d達(dá)高峰，然后逐漸降低，維持到第7天，nestin陽性細(xì)胞主要分布在海馬、皮質(zhì)區(qū)。腦溢安組與模型組3 d后各時(shí)間點(diǎn)存在顯著性差異，能夠維持被激活的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。

劉伯炎等[24]還觀察了中藥補(bǔ)陽還五湯對(duì)大鼠局灶性腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)正常大鼠腦組織中存在少量的神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)，主要分布在皮質(zhì)區(qū)，腦缺血后NSC增殖，以皮質(zhì)、缺血周圍區(qū)增加明顯，健側(cè)海馬區(qū)可見NSC啟動(dòng)，1 d開始增多，5 d達(dá)到高峰。補(bǔ)陽還五湯組與模型組比較在5 d、7 d存在明顯差異，更能促進(jìn)并維持NSCs的增殖。

3　問題與展望

干細(xì)胞移植治療各種疾病近年來受到了廣泛的關(guān)注，胚胎干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞的定向分化也成了研究的熱點(diǎn)之一。雖然實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法現(xiàn)在得到了很大的改進(jìn)，但是在很多方面都存在問題，如胚胎干細(xì)胞的來源、定向分化的方法的選擇、移植后免疫排斥的問題等。自體骨髓干細(xì)胞移植雖然能解決胚胎干細(xì)胞的來源困難、免疫排斥的問題，但是骨髓干細(xì)胞的分離純化困難、表達(dá)率低等也是迄待解決的關(guān)鍵所在。中藥干預(yù)的研究興起較晚，目前也僅是局限于體外實(shí)驗(yàn)研究階段，不管是單藥提取還是復(fù)方制劑在體外培養(yǎng)都脫離了人體環(huán)境，這違背了中醫(yī)整體觀念和辨證論治的思維方法。但是干細(xì)胞的移植還是為臨床實(shí)踐帶來了希望，目前骨髓干細(xì)胞治療遺傳變性疾病已取得了可喜的成果。

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